专利名称：：一种检测水产品中环丙沙星残留的酶联免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物工程
技术领域：
，涉及一种检测水产品中环丙沙星残留的酶联免疫试剂盒。
背景技术：
：环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)又称环丙氟哌酸，是第三代氟喹诺酮类药物。该药杀菌能力强、抗菌谱广曾被普遍的应用在水产动物的疾病治疗中。然而人类长期食用含环丙沙星残留的水产品会对健康造成损害，引发食源性疾病。目前，环丙沙星已经被欧盟、中国等列为水产养殖禁用药物。目前，环丙沙星的检测方法主要包括微生物法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等。这些检测方法不仅需要以实验室平台为依托，还需要有专门的实验人员进行操作。其中微生物法虽然要求不高，但是检测的灵敏度达不到国家标准。高效液相色谱法、毛细管电泳法虽然灵敏度高，能够进行大规模检测，但是所花费的时间长、购买仪器的费用也非常的高一般在30万元以上。酶联免疫竞争法(ELISA)具有灵敏度高、操作简单、成本低、检测速度快等特点，因此利用酶联免疫竞争法(ELISA)建立灵敏度高、操作简单、能快速检测水产品中环丙沙星的试剂盒将有着十分广泛的应用前景。
发明内容本发明的目的是提供一种操作简单、价格低廉、灵敏快速的用于检测水产品中环丙沙星残留的酶联免疫试剂盒。本发明的酶联免疫试剂盒包括包被有环丙沙星-鸡卵血清白蛋白偶联物(CIP-0VA)的酶标板、环丙沙星单克隆抗体、环丙沙星(CIP)标准品溶液、酶标二抗、底物显色液、洗液、终止液。所述包被酶标板的包被原CIP-OVA，为环丙沙星与鸡卵血清白蛋白偶联物，制备过程如下(1)先将鸡卵血清白蛋白水溶液、环丙沙星水溶液、1_乙基_(3-甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液以摩尔比为1:340:7043混合，在室温下反应2小时；(2)将反应后的液体装入透析袋内，再放入1L磷酸缓冲液中透析48小时，每24小时换液一次；所述的磷酸缓冲液PH为5.0，浓度为0.01mol/L;所述的透析袋半周长为22mm，截留分子量为14000;(3)收集透析袋内的液体，在_201:预冷冻2小时，然后在-S(TC下冷冻干燥，制成环丙沙星包被原白色固体粉末。其中所述包被有环丙沙星-鸡卵血清白蛋白偶联物的酶标板，是将环丙沙星-鸡卵血清白蛋白偶联物用包被缓冲液(pH9.6，0.lmol/L的碳酸盐缓冲液)稀释到一定浓度后，加入酶标板37°C，lh，再用PBST(0.01mol/L的磷酸盐缓冲液加入0.5%的吐温20)洗涤，最后加入1%牛血清白蛋白溶液封闭过夜制得。其中所述的环丙沙星单克隆抗体是由杂交瘤细胞株JY-1(CCTCCNO.C200947)分泌获得。所述的环丙沙星(CIP)标准品溶液的浓度为0.lng/mL、lng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL。所述的底物显色液包括O.03%过氧化氢，1.5mg/mL的四甲基联苯胺和pH5.3的醋酸钠缓冲液。其中所述的洗液为含有0.5%吐温20的磷酸缓冲液。其中所述的终止液为2mol/L的硫酸。所述的酶联免疫试剂盒检测水产品中环丙沙星残留的免疫学方法，其特征在于包括以下步骤(1)样品前处理取均质过的样品，加入乙腈作为提取液，捣碎匀浆，振荡离心后取上清液；往残渣中加入提取溶剂乙腈，重复上述操作1次，合并上清液，取一定量的上清液做分析；(2)样品检测将处理过的样品上清液和环丙沙星标准溶液分别加入酶标板，同时加入权利要求3所述的环丙沙星单克隆抗体标准溶液；温育后洗涤拍干，加入酶标抗抗体；温育后洗涤拍干，加入显色液；温育后加入终止液，用酶标仪测定吸光度值；(3)结果分析以标准溶液的抑制率B/B。为纵坐标，以不同浓度环丙沙星的对数值为横坐标，绘制标准抑制曲线，根据标准曲线计算得出样品中的环丙沙星浓度。本发明的又一目的是提供一种能够用于检测水产品中环丙沙星残留的免疫学方法，它包括以下步骤1、样品前处理；2、样品检测；3、结果分析。(1)样品前处理(鲫鱼、舻鱼、鲑鱼、螃蟹、罗氏沼虫下)取均质过的样品，加入乙腈作为提取液，高速组织捣碎机匀浆，充分振荡离心后取上清液。往残渣中加入提取溶剂，重复上述操作l次，合并上清液，取一定量的上清液做分析。(2)样品检测将处理过的样品上清液和环丙沙星标准溶液分别加入酶标板，同时加入环丙沙星单克隆抗体标准溶液；温育后洗涤拍干，加入酶标抗抗体；温育后洗涤拍干，加入显色液；温育后加入终止液，用酶标仪测定吸光度值。(3)结果分析以标准溶液的抑制率B/B。为纵坐标(B是环丙沙星不同标准浓度的0D45。值，B。是环丙沙星浓度为0时的0D45。值)，以不同浓度环丙沙星的对数值为横坐标，绘制标准抑制曲线，样品中的环丙沙星浓度可以根据标准曲线计算得出。本发明具有以下优点(1)本发明的试剂盒灵敏度高，最低检测限能够达到1.02ng/mL，与以往试剂盒比较灵敏度提高i-io倍。(2)本发明的试剂盒特异性强，仅有恩诺沙星存在交叉反应，对其它氟喹诺酮类药物不存在交叉反应。(3)本发明的试剂盒所使用的单克隆抗体能够稀释30000-200000倍使用，与以往试剂盒所使用单克隆抗体的稀释倍数比较，提高了io倍以上，从而节约了成本。(4)本发明中的前处理方法，操作简单易于实施。图1为环丙沙星偶联物紫外扫描图。图2为试剂盒标准抑制曲线。具体实施例方式(1)本发明所用试剂环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、培氟沙星，含量^98.5%，购自浙江国邦药业有限公司；牛血清蛋白(BSA)、鸡卵血清白蛋白(0VA)、酶标板、HRP羊抗鼠抗抗体、四甲基联苯胺、吐温20购于鼎国生物公司；乙基碳二亚胺(EDC)，纯度^99.3X，购自上海延长生化科技发展有限公司；1640培养基(购自GIBCO公司)；胎牛血清(购自HYCLONE公司)；HAT(购自GIBCO公司)；小牛血清(购自HYCLONE公司)；二甲亚砜(购自SIGMA公司)，其它化学试剂购于上海国药有限公司。(2)Balb/c小鼠，购自上海实验动物中心；SP2/0骨髓瘤细胞，购自中科院细胞库。实施例一免疫原——环丙沙星与牛血清白蛋白偶联物(CIP-BSA)的制备1、称取8.5g的氯化钠、2.85g磷酸氢二钠、0.2g氯化钾，O.27g磷酸二氢钾加入950mL的蒸馏水，滴加盐酸调节pH(酸碱度)至5.0，再加入50mL的蒸馏水，配置成1000mL，浓度为0.Olmol/L的磷酸缓冲液。2、称取40mg的牛血清白蛋白加入5mL的磷酸缓冲液(pH为5.0，含量为0.01mo1/L)制成8mg/mL(0.12iimol/L)的牛血清白蛋白水溶液。3、称取100mg的环丙沙星加入5mL的磷酸缓冲液(pH为5.0，含量为0.Olmol/L)制成20mg/mL(60.4ymol/L)的环丙沙星水溶液。4、称取960mg碳二亚胺加入4mL磷酸缓冲液(pH为5.0，含量为0.Olmol/L)制成240mg/mL(1251.9iimol/L)的水溶液。5、在1.5mL的离心管中分别加入8mg/mL(0.12ymol/L)的牛血清白蛋白水溶液、20mg/mL(60.4ymol/L)的环丙沙星水溶液、240mg/mL(1251.9ymol/L)的碳二亚胺水溶液各0.25mL，再加入0.25mL的磷酸缓冲液(pH为5.0，含量为0.Olmol/L)，在室温下反应2小时。6、将反应好的液体加入透析袋(半周长22mm，截留分子量14000)中再放入装有1L磷酸缓冲液(pH为5.0，含量为0.0lmo1/L)的烧杯中，透析48小时，每24小时换液一次。7、将透析好的液体，在_201:预冷冻2小时，然后在-S(TC下冷冻干燥，制成免疫原白色固体粉末。实施例二包被原——环丙沙星与鸡卵血清白蛋白偶联物(CIP-OVA)的制备1、称取8.5g的氯化钠、2.85g磷酸氢二钠、0.2g氯化钾，O.27g磷酸二氢钾加入950mL的蒸馏水，滴加盐酸调节pH(酸碱度)至5.0，再加入50mL的蒸馏水，配置成1000mL，浓度为0.Olmol/L的磷酸缓冲液。2、称取40mg的鸡卵血清白蛋白加入5mL的磷酸缓冲液(pH为5.0，含量为0.Olmol/L)制成8mg/mL(0.178iimol/L)的鸡卵血清白蛋白水溶液。3、称取lOOmg的环丙沙星加入5mL的磷酸缓冲液(pH为5.0，含量为0.Olmol/L)制成20mg/mL(60.4ymol/L)的环丙沙星水溶液。4、称取960mg碳二亚胺加入4mL磷酸缓冲液(pH为5.O，含量为0.Olmol/L)制成240mg/mL(1251.9iimol/L)的水溶液。5、在1.5mL的离心管中分别加入8mg/mL(0.178ymol/L)的鸡卵血清白蛋白水溶液、20mg/mL(60.4iimol/L)的环丙沙星水溶液、240mg/mL(1251.9ymol/L)的碳二亚胺水溶液各0.25mL，再加入0.25mL的磷酸缓冲液(pH为5.0，含量为0.Olmol/L)，在室温下反应2小时。6、将反应好的液体加入透析袋(半周长22mm，截留分子量14000)中再放入装有1L磷酸缓冲液(pH为5.0，含量为0.0lmo1/L)的烧杯中，透析48小时，每24小时换液一次。7、将透析好的液体，在-2(TC预冷冻2小时，然后在-5(TC下冷冻干燥，制成包被原白色固体粉末。实施例三环丙沙星单克隆抗体的制备—、免疫将环丙沙星-牛血清白蛋白粉末用磷酸缓冲液(pH为5.O，含量为0.01mol/L)稀释成为2mg/mL免疫原溶液，取100yL免疫原溶液(2mg/mL)加入100yL福氏完全佐剂，充分混匀后，取4周龄的Balb/c小鼠，采用腹部注射，进行免疫。免疫两周后，取100iiL免疫原溶液(2mg/mL)加入100yL福氏不完全佐剂，充分混匀后，采用腹部注射，进行免疫。—周后，取100iiL免疫原溶液(2mg/mL)进行尾静脉加强免疫。十天后，取50iiL免疫原溶液(2mg/mL)进行尾静脉注射，进行加强免疫。二、细胞融合及筛选1、骨髓瘤细胞的复苏及培养融合前10天，将冷冻的SP2/0骨髓瘤细胞从-70°〇冰箱中取出，立即放入37。C水浴融化，1000转/分钟离心3分钟，加入1640(含10%胎牛血清)培养液，置4.5%C02培养箱内培养。处于对数生长期的瘤细胞浑圆，透亮，大小均一，排列整齐，呈半致密分布，取处于对数生长期的骨髓瘤细胞供细胞融合用。2、融合(1)在Balb/c小鼠最后一次免疫的第三天，无菌取脾脏过100目网筛，用RPMI1640(-)吹下形成单细胞悬液，用于细胞融合。(2)Balb/c小鼠，无菌取出胸腺后，过100目网筛，用RPMI1640(-)吹下形成单细胞悬液。(3)将脾细胞悬液和胸腺细胞悬液分别离心3分钟，1000转/分钟，弃去上清液，脾细胞沉淀用预热到37t:的RPMI1640(-)重悬，胸腺细胞沉淀用少量预热到37t:的含1%HAT的1640(含10%胎牛血清)选择性细胞培养液重悬。(4)取3Xl(f个处于对数生长期的骨髓瘤细胞，1000转/分钟离心3分钟，去上清液后，沉淀用RPMI1640(-)重悬。(5)将脾细胞悬液与瘤细胞悬液混合均匀后，1000转/分钟离心3分钟，完全吸去上清液，轻弹离心管底，使两种细胞沉淀充分混匀。(6)将离心管置于37t:水浴中预热的盛水烧杯中，用吸管吸已经预热到37t:的聚乙二醇溶液lmL，将管尖插入管底，轻轻搅动细胞沉淀，并缓缓滴加聚乙二醇，在1分钟内加完。然后在37t:水浴中静置5分钟。(7)滴加已经预热到37。C的RPMI1640(-)液40mL，前缓后快，然后1000转/分钟离心5分钟，弃去上清液。(8)将细胞沉淀用3mL预热到37°C的1640(含10%胎牛血清)细胞培养液重悬，取2mL冻存于-70°C(9份1640(含10%胎牛血清)+1份二甲亚砜)，余细胞悬液里补加含有1%HAT的1640(含10%胎牛血清)选择性细胞培养液和小鼠胸腺细胞40mL，混合均匀后每孔100iiL滴加到4个96孔板内。培养于C02浓度为4.5%和37。C恒温恒湿条件下的(A培养箱中。(9)细胞融合2周后，杂交瘤细胞群落长到占96孔培养板的孔底1/3时开始用间接酶联免疫法检测。选取阳性值大于阴性值2倍，且阳性值大于0.5以上的细胞孔进行克隆，采用有限稀释法对检测出的阳性杂交瘤细胞进行克隆，直到获得稳定分泌环丙沙星单克隆抗体的细胞株。选取其中一株细胞株命名为JY-1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCNO.200947。三、单克隆抗体的产生与纯化(原腹水制备)取7周的Balb/c小鼠，每只注射0.5mL的降植烷。一周后腹腔接种用无血清培养基稀释处于对数生长期的杂交瘤细胞，每只注射细胞数为5X106个，间隔4天后，观察小鼠腹水情况，待小鼠腹部膨大，精神变差，濒临死亡时，采集腹水。将腹水离心，取上清液，测定效价，分装保存在_7(TC。用硫酸铵沉淀法进行纯化，得到环丙沙星单克隆抗体。实施例四检测水产品中环丙沙星残留的酶联免疫试剂盒的组装1、试剂盒试剂的配制(1)磷酸缓冲液(PBS)缓冲液称取8.5g的氯化钠、2.85g磷酸氢二钠、0.2g氯化钾，0.27g磷酸二氢钾加入950mL的蒸馏水，滴加盐酸调节pH(酸碱度)至7.4，再加入50mL的蒸馏水，配置成1000mL，浓度为0.Olmol/L的磷酸缓冲液。(2)抗原包被液(CBS)碳酸盐缓冲液称取1.59g的碳酸钠，2.93g的磷酸氢钠，加入蒸馏水950mL，调节pH(酸碱度)至9.6加蒸馏水至1000mL。4度保存。(3)封闭液称取lg牛血清白蛋白，溶解于100mL的PBS中，混匀4"保存备用。(4)洗涤液将0.5mL吐温20加入1L的PBS中，混匀，室温保存备用。(5)显色液①四甲基联苯胺(TMB)贮存液称150mg的TMB粉末，加入100mL的二甲基亚砜配成1.5mg/mL的TMB贮存液，一2(TC分装保存。②醋酸钠(NaAc)缓冲液称取16.4g的醋酸钠加入950mL的蒸馏水，用醋酸调节pH至5.3，加蒸馏水至1000mL。③0.03%双氧水吸取lmL的30%的双氧水加入1L的蒸馏水。④使用时显色液配方TMB贮存液醋酸钠缓冲液0.03%双氧水的体积比为i:4:5。(6)终止液(2M硫酸)将100mL浓硫酸缓慢加入900mL蒸馏水中，室温保存备用。2、包被有环丙沙星-鸡卵血清白蛋白偶联物的酶标板的制备(1)将环丙沙星-鸡卵血清白蛋白偶联物用包被碳酸盐缓冲液稀释到100ng/mL。(2)将稀释后的环丙沙星-鸡卵血清白蛋白偶联物加入酶标板(100iiL/孔)37t:孵育1小时后，倒去包被液并用洗涤液洗涤3次，每次3min，最后加入封闭液(200yL/孔)封闭过夜。(3)倒去封闭液并用洗液洗涤3次，每次3min，干燥后用铝膜真空密封保存。3、组建的环丙沙星检测试剂盒由下述部分组成(1)包被有环丙沙星-鸡卵血清白蛋白偶联物的酶标板；(2)环丙沙星单克隆抗体；(3)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；(4)环丙沙星标准品溶液5瓶，浓度分别为0.lng/mL、lng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL;(5)显色A液0.03X过氧化氢，显色B液1.5mg/mL的四甲基联苯胺，显色C液醋酸钠缓冲液；(6)洗涤液；(7)终止液。实施例五样品中环丙沙星残留的检测1、样品前处理(鲫鱼、舻鱼、鲑鱼、螃蟹、罗氏沼虫下)取5g的样品，加入30mL的乙腈作为提取液，高速组织捣碎机匀浆，充分振荡15min，4500r/min离心15min，取上清液。往残渣中加入提取溶剂30mL，重复上述操作1次，合并上清液，取50iiL做分析。2、用试剂盒检测(1)取50iiL的样品和50iiL的标准品溶液分别加入包被有环丙沙星_鸡卵血清白蛋白偶联物的酶标板中，然后加入环丙沙星单克隆抗体工作液50iiL，37t:孵育1小时。(2)倒出孔中液体，加入洗液(200iiL/孔)洗涤3次，每次3min，拍干。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液(100yL/孔)，37t:孵育0.5小时。(3)倒出孔中液体，加入洗液(200iiL/孔)洗涤3次，每次3min，拍干。每孔加入显色A液50iiL，显色B液10iiL，显色C液40iiL，37。C避光孵育10分钟。(4)每孔加入50iiL终止液，用酶标仪在450nm处读数(OD)。结果分析以标准溶液的抑制率B/B。为纵坐标(B是环丙沙星不同标准浓度的0D45。值，B。是环丙沙星浓度为0时的0D45。值)，以不同浓度环丙沙星的对数值为横坐标，绘制标准抑制曲线。样品中的环丙沙星浓度可以根据标准曲线计算得出。根据酶标板上的样品颜色的深浅，与系列浓度的标准溶液颜色的比较可判断样品中环丙沙星的浓度范围。实施例六特性鉴定为了验证本发明的有效性，进行了以下测定。—、免疫原、包被原的偶联鉴定通过紫外分光光度法对免疫原(CIP-BSA)及包被原(CIP-OVA)进行鉴定。在250nm-350nm间对CIP、BSA、CIP-BSA、OVA、CIP-OVA进行紫外扫描。结果发现CIP的峰值在270nm，BSA的峰值在279nm，CIP-BSA的峰值出现在275nm，0VA的峰值出现在278nm，CIP-OVA的峰值出现在274nm，通过对比发现偶联物的峰值发生了迁移，从而证明了偶联的成功。见图l为环丙沙星偶联物紫外扫描图。二、试剂盒竞争抑制曲线测定将环丙沙星标准品(0.lng/mL、lng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL)和环丙沙星单克隆抗体工作液各50iiL加入酶标板，37°C，1小时，洗板三次。加入酶标二抗100iiL，37°C，0.5小时，洗板三次。加入显色液，显色10分钟，酶标仪D顿nm读数。结果见图2，得到线性方程为y=-23.lx+80.3，R2=0.9811。通过计算得到的最低检测限为1.02ng/mL。三、试剂盒特异性鉴定系列稀释环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、培氟沙星，检测试剂盒的特异性。在试剂盒中加入检测药物、环丙沙星单克隆抗体工作液各50uL，37t:，1小时，洗板三次。加入酶标二抗100yL，37。C，0.5小时，洗板三次。加入显色液，显色IO分钟，加入浓硫酸终止反应，酶标仪D45。nm读数。分别作抑制曲线，根据拟合曲线计算半数抑制浓度。依据公式计算交叉反应率=IC5。环丙沙星/IC5。被测组药物X100%结果表明恩诺沙星与环丙沙星存在90%的交叉反应，而诺氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、培氟沙星与环丙沙星均无交叉反应。表1与其它药物的交叉反应表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>四、试剂盒的准确度实验取两个浓度的环丙沙星标准样，对样品进行添加回收试验，每个浓度做4个平行，分别计算回收率。表2试剂盒回收率测定<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>结果表明鲫鱼肌肉样品的添加回收率为86.3%103.3%，虾肌肉样品的添加回收率为86.2%117.5%。五、试剂盒精密度试验从4批试剂盒中各取10个试剂盒，每个试剂盒抽取20个微孔，测定10ng/mL标准溶液的吸光度值(OD值)，计算变异系数。测定结果见表3表3试剂盒精密度试验<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>[O130]结果测定范围在4.79.8%之间，确定精密度的变异性系数范围《10%。权利要求一种用于检测水产品中环丙沙星残留的酶联免疫试剂盒，其特征在于它包括下列组分(1)包被有环丙沙星-鸡卵血清白蛋白偶联物(CIP-OVA)的酶标板；(2)环丙沙星单克隆抗体；(3)环丙沙星(CIP)标准品溶液；(4)酶标二抗；(5)底物显色液；(6)洗液；(7)终止液。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述包被酶标板的包被原CIP-OVA，为环丙沙星与鸡卵血清白蛋白偶联物，其制备过程如下(1)先将鸡卵血清白蛋白水溶液、环丙沙星水溶液、1_乙基_(3-甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液以摩尔比为1:340:7043混合，在室温下反应2小时；(2)将反应后的液体装入透析袋内，再放入1L磷酸缓冲液中透析48小时，每24小时换液一次；所述的磷酸缓冲液pH为5.0，浓度为0.Olmol/L;所述的透析袋半周长为22mm，截留分子量为14000;(3)收集透析袋内的液体，在_201:预冷冻2小时，然后在_501:下冷冻干燥，制成环丙沙星包被原白色固体粉末。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的环丙沙星单克隆抗体是由杂交瘤细胞株JY-1(CCTCCNO.C200947)分泌获得。4.如权利要求l所述的试剂盒，其特征在于所述的环丙沙星(CIP)标准品溶液的浓度为0.lng/mL、lng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL。5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的底物显色液包括0.03%过氧化氢，1.5mg/mL的四甲基联苯胺和pH5.3的醋酸钠缓冲液。6.—种应用如权利要求1至5中任一所述的酶联免疫试剂盒检测水产品中环丙沙星残留的免疫学方法，其特征在于包括以下步骤(1)样品前处理取均质过的样品，加入乙腈作为提取液，捣碎匀浆，振荡离心后取上清液；往残渣中加入提取溶剂乙腈，重复上述操作1次，合并上清液，取一定量的上清液做分析；(2)样品检测将处理过的样品上清液和环丙沙星标准溶液分别加入酶标板，同时加入权利要求3所述的环丙沙星单克隆抗体标准溶液；温育后洗涤拍干，加入酶标抗抗体；温育后洗涤拍干，加入显色液；温育后加入终止液，用酶标仪测定吸光度值；(3)结果分析以标准溶液的抑制率B/B。为纵坐标，以不同浓度环丙沙星的对数值为横坐标，绘制标准抑制曲线，根据标准曲线计算得出样品中的环丙沙星浓度。全文摘要本发明公开了一种检测水产品中环丙沙星残留的酶联免疫试剂盒，该试剂盒主要包括包被有环丙沙星-鸡卵血清白蛋白偶联物(CIP-OVA)的酶标板、环丙沙星单克隆抗体、环丙沙星(CIP)标准品溶液、酶标二抗、底物显色液、洗液、终止液。本发明还公开了一种利用上述试剂盒检测水产品中环丙沙星残留的方法，它包括以下步骤首先对样品进行前处理，然后利用试剂盒检测，最后分析实验结果。本发明提供的试剂盒操作简便、灵敏度高、特异性强，适合大规模的样品检测。文档编号G01N33/577GK101710124SQ200910200078公开日2010年5月19日申请日期2009年12月8日优先权日2009年12月8日发明者付乔芳,喻文娟,姜有声,杨先乐,胡鲲,陈力,黄宣运申请人:上海海洋大学