专利名称：一种火锅底料中罗丹明b的快速检测方法
技术领域：
本发明属于食品检测技术领域，涉及一种食品组分的检测方法，具体涉及一种火锅底料中罗丹明B的快速检测方法。
背景技术：
罗丹明B又称若丹明B、玫瑰红、花粉红等，英文名称为Rhodamine B，是一种人工合成的工业染料，主要用于纺织品、皮革制品、木制品、有色玻璃等的染色，与苏丹红一样对人体具有致癌作用，2008年被中国卫生部列入第一批食品中可能违法添加的非食用物质黑名单，但由于罗丹明B具有价格低廉、色泽红艳、稳定性强等特点，常被不法商贩用作替代食品添加剂的着色剂，严重危害人们的饮食安全。火锅是我国民间流行的美食，流行于全国各地，目前已形成巨大的饮食产业，火锅底料是火锅饮食中不可缺少的原料之一，主流的火锅底料主要由辣椒、豆瓣、牛油、植物油等构成，一些不法分子为了追求产品的色泽，在辣椒、豆瓣等原料或火锅底料产品中非法添加工业染料罗丹明B，危害人们的饮食安全，2011年春节期间，深圳、重庆、河北、四川等地从火锅底料中查出违法添加的罗丹明B，加剧了人们对罗丹明B的担忧，对火锅底料中罗丹明B进行快速检测具有积极的意义。目前食品中罗丹明B的检测方法主要有高效液相色谱_荧光检测法、高效液相色谱_紫外检测法、液相色谱_串联质谱法，但这些方法的样品前处理均需要采用固相萃取或凝胶渗透色谱净化，过程复杂、成本高、周期长，检测过程采用反向C18色谱柱分离，专属性差，易产生干扰，而且没有专门针对火锅底料样品的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种火锅底料中罗丹明B的快速检测方法，解决了现有火锅底料中罗丹明B的检测方法存在的样品前处理均需要采用固相萃取或凝胶渗透色谱净化， 过程复杂、成本高、周期长，且检测过程采用反向C18色谱柱分离，专属性差，易产生干扰的问题。本发明所采用的技术方案是，一种火锅底料中罗丹明B的快速检测方法，具体按照以下步骤实施步骤1 称取一定量的待检测的火锅底料，根据称取的待检测的火锅底料与饱和氯化钠溶液的质量_体积浓度为250_400g/L称取饱和氯化钠溶液，根据称取的待检测的火锅底料与乙腈的质量_体积浓度为100_200g/L称取乙腈，根据称取的待检测的火锅底料与正己烷的质量_体积浓度为100-200g/L称取正己烷，将称取的待检测的火锅底料、饱和氯化钠溶液、乙腈及正己烷混合置于具塞离心管中，振荡10 20min，以4000 6000r/min的速度离心4 lOmin，用注射器吸取1 2mL乙腈层，将吸取的乙腈层过0. 2 μ m有机微孔滤膜，得到净化后的火锅底料；步骤2 采用液相色谱仪对步骤1得到的净化后的火锅底料进行离子交换色谱-荧光检测，得到火锅底料的液相色谱图，根据液相色谱图判断火锅底料中是否有罗丹明B及定量。
本发明的特点还在于，其中步骤2中的离子交换色谱-荧光检测，设置检测参数SCX强阳离子交换色谱柱柱长250mm，柱内径4. 6mm,填料粒径5 μ m ；流动相体积比为4 6的乙腈-0. 1 %氨水溶液，等度洗脱；流速0. 8 1. 2mL/min ；柱温30 40°C ；进样量10 100 μ L ；激发波长548 552nm，发射波长578 582nm。其中步骤2中根据液相色谱图判断火锅底料中是否有罗丹明B的判断标准为如果样品的液相色谱图在罗丹明B标准溶液色谱出峰位置有色谱峰出现，而且信噪比大于5， 则判断样品中含有罗丹明B，如果样品的液相色谱图在罗丹明B标准溶液色谱出峰位置没有色谱峰出现，则样品中未检出罗丹明B。其中步骤2中罗丹明B的定量采用标准曲线法或者外标一点法。本发明的有益效果是，将样品提取、净化在一步完成，免去了传统方法中的固相萃取或凝胶渗透净化过程，节省样品前处理时间5倍以上，降低前处理成本10倍以上，利用选择性强的离子交换色谱柱分离样品，并结合专属性强的荧光检测器检测，可以大幅提高抗干扰能力，避免假阳性结果，提高检测结果的准确性。本检测方法完整检测一个样品仅需不到40min时间，试剂成本2元左右，检出限可达到5 μ g/kg，检测周期短、检测成本低、检测结果准确、灵敏度高，适合生产企业及管理部门进行产品质量检测，在大批量样品检测时更能体现本方法的检测速度及检测成本优势。
图1为罗丹明B的化学结构式；图2为2ng/mL的罗丹明B标准溶液的液相色谱图；图3为试剂空白液相色谱图；图4为火锅底料样品液相色谱图；图5为火锅底料样品加标水平为10 μ g/kg的液相色谱图；图6为罗丹明B的可见光吸收图谱。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明进行详细说明。本发明火锅底料中罗丹明B的快速检测方法，具体按照以下步骤实施步骤1 称取一定量的待检测的火锅底料，进行提取和净化，根据称取的待检测的火锅底料与饱和氯化钠溶液的质量_体积浓度为250-400g/L称取饱和氯化钠溶液，根据称取的待检测的火锅底料与乙腈的质量-体积浓度为100-200g/L称取乙腈，根据称取的待检测的火锅底料与正己烷的质量-体积浓度为100-200g/L称取正己烷，混合置于具塞离心管中，振荡提取10 20min，4000 6000r/min离心4 lOmin，用注射器吸取1 2mL乙腈层(中间层)，过0.2μπι有机微孔滤膜，得到净化后的火锅底料样品；步骤2 采用液相色谱仪进行离子交换色谱_荧光检测，设置检测参数为色谱柱 SCX强阳离子交换色谱柱(柱长250mm，柱内径4. 6mm，填料粒径5 μ m)，或相当者；流动相乙腈-0. 氨水溶液(4+6，体积比)等度洗脱；流速0. 8 1. 2mL/min ；柱温30 40°C； 进样量10 100 μ L ；激发波长(Ex) 548 552nm，发射波长(Em) 578 582nm，对上步得到的火锅底料样品进行检测，得到火锅底料样品的液相色谱图，如果样品的液相色谱图在罗丹明B标准溶液色谱出峰位置有色谱峰出现，而且信噪比大于5，则可判断样品中含有罗丹明B，反之，如果样品的液相色谱图在罗丹明B标准溶液色谱出峰位置没有色谱峰出现，则样品中未检出罗丹明B。样品中的罗丹明B采用外标法进行定量，定量方法可选择标准曲线法或外标一点法。实施例1称取lg(精确至0. Olg)不含有罗丹明B的火锅底料样品于50mL具塞离心管中， 添加50ng罗丹明B标准，加入4. OmL饱和氯化钠溶液、IOmL乙腈、IOmL正己烷，振荡提取 IOmin, 4000r/min离心lOmin，用注射器吸取约2mL乙腈层，过0. 2 μ m有机微孔滤膜。分析时采用Supelco SCX色谱柱(柱长250mm，柱内径4. 6mm,填料粒径5 μ m)，流动相为乙腈-0. 氨水溶液(4+6，体积比)，流速1.0111171^11，柱温351，进样量5(^1^，激发波长 550nm，发射波长580nm，加标样品中罗丹明B在7. Imin出峰，与标准溶液中罗丹明B的出峰时间相同，利用标准曲线法计算得到样品溶液中罗丹B的含量为9. 53ng/mL,回收率为 95. 3%。实施例2称取2g(精确至O.Olg)不含有罗丹明B的火锅底料样品于50mL具塞离心管中，添加IOOng罗丹明B标准，加入5mL饱和氯化钠溶液、IOmL乙腈、IOmL正己烷，振荡提取15min， 5000r/min离心6min，用注射器吸取约1. 5mL乙腈层，过0. 2 μ m有机微孔滤膜。分析时采用Supelco SCX色谱柱(柱长250mm，柱内径4. 6mm,填料粒径5 μ m)，流动相为乙腈-0. 1 % 氨水溶液(4+6，体积比)，流速0. 8mL/min,柱温40°C，进样量100 μ L，激发波长548nm，发射波长578nm，加标样品中罗丹明B在7. 5min出峰，与标准溶液中罗丹明B的出峰时间相同， 利用标准曲线法计算得到样品溶液中罗丹B的含量为9. 85ng/mL,回收率为98. 5%。实施例3称取3g(精确至O.Olg)不含有罗丹明B的火锅底料样品于50mL具塞离心管中，添加150ng罗丹明B标准，加入9mL饱和氯化钠溶液、18mL乙腈、18mL正己烷，振荡提取20min， 6000r/min离心4min，用注射器吸取约2mL乙腈层，过0. 2 μ m有机微孔滤膜。分析时采用 Supelco SCX色谱柱(柱长250mm，柱内径4. 6mm，填料粒径5 μ m)，流动相为乙腈-0. 1 %氨水溶液(4+6，体积比)，流速1. 2mL/min,柱温30°C，进样量10 μ L，激 发波长552nm，发射波长582nm，加标样品中罗丹明B在6. Imin出峰，与标准溶液中罗丹明B的出峰时间相同，利用标准曲线法计算得到样品溶液中罗丹B的含量为9. 72ng/mL,回收率为97. 2%。以下从原理方面对本发明进行说明液相色谱条件的选择罗丹明B的化学结构式如图1所示，其结构中含有两个可以形成正离子的含氮基团，适合用阳离子交换色谱进行分离分析。传统的罗丹明B分析均采用反向C18色谱柱，而C18色谱柱主要依靠化合物的极性大小来分离不同化合物，选择性低，样品分析时要排除干扰就必须要有净化良好的样品前处理过程，会延长样品检测的时间，升高检测成本。阳离子交换色谱柱只对能够阳离子化的化合物有色谱保留，所以专属性强，抗干扰能力强，可以简化样品的前处理，所以选择阳离子交换色谱柱分析罗丹明B。
阳离子交换色谱常用的流动相 是磷酸盐缓冲液和有机相，并通过调节磷酸盐缓冲液的PH值及有机相的比例来调整化合物的出峰时间及峰形，实验中先考察了 0. lmol/L磷酸二氢钠缓冲液与乙腈作为流动相的情况，缓冲液与乙腈的体积比为1 1(因缓冲液中盐浓度较高，乙腈比例最好不要超过50%，否则会造成盐析出，损坏色谱系统)，当磷酸二氢钠缓冲液PH为3. 0时，罗丹明B吸附在阳离子交换色谱柱上，不能被洗脱下来，当磷酸二氢钠缓冲液PH为5. 6时，罗丹明B在13min左右出峰，但峰形胖，灵敏度低，当调节磷酸二氢钠缓冲液pH为8. 0时，罗丹明B出峰时间提前，峰形改善，但考虑到磷酸二氢钠缓冲液配制比较复杂而且高浓度的缓冲盐体系不适合大体积的有机溶剂(本方法中为乙腈)直接进样， 对液相色谱系统也有害，后来选择0. 氨水溶液和乙腈系统进行实验，当0. 氨水溶液与乙腈为1 1时，罗丹明B在5min左右出峰，峰形尖锐，但出峰时间过早，少数样品会出现一小的干扰峰，而0. 氨水溶液与乙腈为3 2时，罗丹明B在7min左右出峰，峰形良好，而且无干扰，所以最终选择0. 氨水溶液-乙腈(3+2)为流动相，标准溶液、试剂空白的液相色谱图如图2、图3所示。接着对进样体积进行了考察，用乙腈溶解标准，分别进样10、20、50、100 μ L时， 罗丹明B的色谱保留时间和色谱峰形无显著差别，为提高检测方法的灵敏度，选择进样 100 μ Lo罗丹明B检测时所用的检测器主要有可见光检测器和荧光检测器，罗丹明B的最大可见吸收为550nm(图6)，荧光激发波长为550nm，荧光发射波长为580nm，可见光检测器检测时选择罗丹明B的最大吸收波长550nm，但罗丹明B的灵敏度仅有荧光检测的二分之一，而且可见光检测的抗干扰能力比荧光检测要差，所以选择荧光检测。将罗丹明B标准溶液(2ng/mL)按上述实验确定的液相色谱条件进样，按5倍信噪比计算方法的检出限，按10倍信噪比计算方法的定量低限，方法的检出限和定量低限分别为 0. 5ng/mL、1. 0ng/mLo提取净化条件的选择罗丹明B易溶于甲醇、乙腈、丙酮，微溶于饱和氯化钠溶液， 在正己烷中溶解度也远低于甲醇和乙腈，传统的方法采用丙酮或甲醇等溶剂提取食品中的罗丹明B，然后采用氧化铝固相萃取柱或凝胶渗透色谱进行净化，操作过程复杂，耗时长，成本高。本检测方法根据罗丹明B的溶解性质和火锅底料的样品特点，考察了甲醇、乙腈、丙酮三种提取溶剂，由于火锅底料中含有较多的油脂和一些水溶性物质，提取净化过程中需要考虑去除这些物质。由于液液萃取的简便性和低成本，考虑用水和正己烷液液萃取来净化，而甲醇和丙酮与水互溶，与正己烷也能够互溶，萃取净化时需要转换溶剂，操作复杂费时，而乙腈在高浓度盐存在的条件下能够与水分层，与正己烷也能够有效分层，所以选择用乙腈进行样品提取，在乙腈提取的同时加入饱和氯化钠溶液和正己烷，振荡提取的同时进行液液分配净化，离心后罗丹明B存在于乙腈层中，大大节省了样品前处理时间和成本。实验中考察了提取净化用乙腈体积和正己烷体积，按照待检测的火锅底料与饱和氯化钠溶液的质量_体积浓度为250-400g/L，与乙腈的质量-体积浓度为100-200g/L，与正己烷的质量_体积浓度为100-200g/L，对净化效果(脱脂)和罗丹明B的加标回收率无显著影响，所以从节省试剂的角度考虑，选择上述比例进行提取和净化。实验中考察了将乙腈层浓缩后定容进样检测和乙腈层过滤后直接进样检测两种方式，将乙腈提取液浓缩至干，用ImL乙腈溶解定容，过滤后进样检测，灵敏度比乙腈层直接进样能够提高10倍，但增加了操作过程，抬高了前处理成本，延长了检测时间，而且乙腈提取液直接进样时方法的定量低限已经达到5 μ g/kg (称样2. Og时)，完全能够满足检测要求，没必要将操作过程复杂化，所以选择将乙腈层过滤后直接进样。火锅底料样品及样品加标(加标水平为 ο μ g/kg)的液相色谱图如图4和图5所示。线性 关系取1.0 μ g/mL的罗丹明B标准中间液，用乙腈逐级稀释，配制成1.0、 2. 0,5. 0,10. 0,20. 0,50. OUOO. Ong/mL的罗丹明B系列标准工作液，按上述实验确定的色谱条件进样，并以罗丹明B的色谱峰面积Y和质量浓度X进行线性拟合，线性回归方程为Y =4. 56X-0. 83，线性相关系数r为0. 9999，表明在1. Ong/mL 100. Ong/mL浓度范围内罗丹明B的线性关系良好。火锅底料中加标回收率及精密度实验确定检测方法后，以不含罗丹明B的火锅底料为测试对象，进行加标回收率实验及精密度实验，以考察方法的适用性。采用5 μ g/kg、 10 μ g/kg、20 μ g/kg三个加标水平，称样2. Og，分别加入10ng、20ng、40ng罗丹明B标准，每个加标水平重复6次，加标回收率及精密度实验结果如表1所示，罗丹明B的加标回收率在 76. 7% 105. 5%范围内，回收率相对标准偏差低于8. 6%，回收率及重现性良好，完全能够满足检测要求。表1阴性火锅底料中罗丹明B加标回收率实验结果(η = 6)
加标水平回收率(%)平均回收率 RSD
(昭/kg) ~2~I2I3~Γ^~~5~ 6(%)(%)
588.4 76.7 93.7 97.6 82.6 91.2 88.48.6
1089.9 94.4 103.1 83.3 90.7 101.3 93.88.0
2096.1 105.5 84.5 92.9 95.7 88.6 93.97.7辣椒及豆瓣酱中加标回收率实验按确定的检测方法，以不含罗丹明B的辣椒和豆瓣酱为测试对象，进行加标回收率实验，以考察方法对这两种样品的适用性。按火锅底料样品最低加标水平5 μ g/kg进行加标，称样2. Og,加入IOng罗丹明B标准，辣椒和豆瓣酱样品均重复加标3次，辣椒样品的加标回收率分别为85. 6%、97. 2%,90. 5%，豆瓣酱样品的加标回收率为92. 8%U02. 4%,95. 3%，回收率均良好，能够满足检测要求。
权利要求
1.一种火锅底料中罗丹明B的快速检测方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施步骤1 称取一定量的待检测的火锅底料，根据称取的待检测的火锅底料与饱和氯化钠溶液的质量_体积浓度为250-400g/L称取饱和氯化钠溶液，根据称取的待检测的火锅底料与乙腈的质量-体积浓度为100-200g/L称取乙腈，根据称取的待检测的火锅底料与正己烷的质量_体积浓度为100-200g/L称取正己烷，将称取的待检测的火锅底料、饱和氯化钠溶液、乙腈及正己烷混合置于具塞离心管中，振荡10 20min，以4000 6000r/min的速度离心4 lOmin，用注射器吸取1 2mL乙腈层，将吸取的乙腈层过0. 2 μ m有机微孔滤膜， 得到净化后的火锅底料；步骤2 采用液相色谱仪对步骤1得到的净化后的火锅底料进行离子交换色谱_荧光检测，得到火锅底料的液相色谱图，根据液相色谱图判断火锅底料中是否有罗丹明B及定量。
2.根据权利要求1所述的火锅底料中罗丹明B的快速检测方法，其特征在于，所述的步骤2中的离子交换色谱-荧光检测，设置检测参数SCX强阳离子交换色谱柱柱长250mm， 柱内径4. 6mm，填料粒径5μπι;流动相体积比为4 6的乙腈-0. 1 %氨水溶液，等度洗脱； 流速0. 8 1. 2mL/min ；柱温30 40°C ；进样量10 100 μ L ；激发波长548 552nm， 发射波长578 582nm。
3.根据权利要求1所述的火锅底料中罗丹明B的快速检测方法，其特征在于，所述的步骤2中根据液相色谱图判断火锅底料中是否有罗丹明B的判断标准为如果样品的液相色谱图在罗丹明B标准溶液色谱出峰位置有色谱峰出现，而且信噪比大于5，则判断样品中含有罗丹明B，如果样品的液相色谱图在罗丹明B标准溶液色谱出峰位置没有色谱峰出现，则样品中未检出罗丹明B。
4.根据权利要求1所述的火锅底料中罗丹明B的快速检测方法，其特征在于，所述的步骤2中罗丹明B的定量采用标准曲线法或者外标一点法。
全文摘要
本发明公开的一种火锅底料中罗丹明B的快速检测方法，称取一定量的待检测的火锅底料、饱和氯化钠溶液、乙腈及正己烷混合置于具塞离心管中，振荡提取10～20min，以4000～6000r/min的速度离心4～10min，用注射器吸取1～2mL乙腈层，过0.2μm有机微孔滤膜，得到净化后的火锅底料；采用液相色谱仪对净化后的火锅底料进行离子交换色谱-荧光检测，得到火锅底料的液相色谱图，根据液相色谱图判断火锅底料中是否有罗丹明B及定量。本发明火锅底料中罗丹明B的快速检测方法快速、灵敏、准确、成本低廉、专属性强、实用性强，适合火锅底料及其生产原料中罗丹明B的快速检测。
文档编号G01N30/02GK102221582SQ201110082949
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月2日 优先权日2011年4月2日
发明者乐爱山, 何强, 吴双民, 孔祥虹, 李建华 申请人:中华人民共和国陕西出入境检验检疫局