专利名称：一种检测血清中螨虫过敏原特异性抗体的方法
技术领域：
本发明涉及诊断技术领域，尤其涉及一种检测血清中螨虫过敏原特异性抗体的方法。
背景技术：
过敏性疾病的发病在现代社会中呈逐年上升的趋势，我国大约有5_10%、美国和欧洲等发达国家大约有5-25%的人受过敏性疾病的困扰。过敏反应又称变态反应，是人类常见的免疫性疾病。但其会引起一系列的临床反应，涉及到胃肠道、皮肤、呼吸道甚至更危险的其它反应，故应该引起足够的重视。诱发过敏反应的抗原称为过敏原，引起过敏反应的抗原物质常见的有2000多种，医学文献记载接近2万种。过敏原可根据其引起过敏的方式分为3类(1)食物过敏，由食用某些食物引起的，如牛奶、蛋类、鱼虾等；( 吸入性过敏， 由鼻腔等吸入某些物质引起的，如花粉、尘螨等；C3)接触性过敏，由于身体接触到某些物质引起的，如化妆品、橡胶制品等。免疫介导的过敏反应有两种类型IgE介导的过敏反应和非IgE介导的过敏反应。IgE介导的过敏反应是引起过敏的主要效应。目前，IgE介导的过敏反应的过敏原的检测在临床上已有多种检测方法。可分为体内检测方法和体外检测方法。体内检测包括双盲对照食物激发实验(DBPCFC)和皮肤点刺试验(SPT)。体内试验虽然简单、快速，但对试验者造成创伤和极大痛苦，且受多因素影响。相对于体内实验，体外实验更加安全，体外检测方法主要包括对血清IgE的检测和组织胺释放试验等。过敏原与IgE，尤其是特异性IgE(SlgE)的结合是过敏原致敏的中心环节， 因此提高过敏原特异性IgE检测的准确性和灵敏度对过敏原的评价和临床过敏症的诊断具有重要意义。IgE介导的过敏反应的致敏过敏原检测方法有多种，如放射过敏原吸附试验 (RAST)、酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫印迹等。针对酶免疫分析已经有多种检测产品，如测定帽(CAP)过敏原检测系统、德国MEDIWISS公司生产的Allergykreen系统及美国ASI 公司生产的过敏反应体外检测系统等，但这些方法的仪器试剂都很昂贵，不适于普及应用。纳米超顺磁性微球是利用纳米技术制备出来的一种内含磁性材料纳米粒子的高分子微球。在外部磁场作用下，纳米超顺磁性能迅速从所在的溶液介质中定向移至磁场作用区，撤去外部磁场，纳米超顺磁性微球又可重悬浮于溶液介质中。同时磁性微球表面通过化学反应形成多种活性功能集团，如-OH，-COOH，-CHO，-NH2等，从而可以共价方式结合具有生物活性的物质，如蛋白，核酸等生物载体。再有纳米级尺度使微球比表面积激增，微球官能团密度及选择性吸收能力变大，达到吸附膨胀的时间缩短，粒子的稳定性大大提高。基于超顺磁性微球的这些特点，其逐渐在生物学、生物技术和生物医学领域得到广泛应用，主要应用于分离浓缩等试验。利用磁性微球比表面积大，易分离，表面可功能化等优点将其用于免疫测定，由于磁性微球代替了其它固相载体而用于免疫分离，与传统方法相比，该方法具有特异性好，灵敏度高，准确性好的特点
发明内容
本发明提供了一种检测血清中螨虫过敏原特异性抗体的方法，解决了传统方法灵敏度和准确性不高的问题。一种检测血清中螨虫过敏原特异性抗体的方法，包括将螨虫过敏原与表面羧基修饰的磁性微球偶联，制得免疫磁性微球；将待测血清与免疫磁性微球置于酶标板的孔内混合孵育，使螨虫过敏原与血清中螨虫过敏原特异性 IgE结合，洗板后采用酶联免疫吸附法进行检测。所述纳米磁性微球的制备方法为(1)将FeCl2溶液和FeCl3溶液混合，在氮气保护下搅拌，升温至50 60°C，保持 10 20min，调节pH值到10-12，升温至60 70°C，搅拌30 60min，加入重量浓度为1 10%的油酸钠溶液，升温至90 100°C，搅拌，制得油酸钠包覆的Fii3O4磁流体；(2)将油酸钠包覆的!^e3O4磁流体聚乙二醇、乙醇和水均勻混合，在氮气保护下搅拌，依次加入过氧化苯甲酰、二乙烯苯和单体苯乙烯、丙烯酸，搅拌30 60min。升温到70 80°C，保持10小时以上，分离，洗涤。 每毫克磁性微球偶联10 μ g 100 μ g螨虫过敏原。所述的免疫磁性微球与待测血清混合前经交联剂活化。所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)溶液。所述免疫磁性微球与待测血清的重量体积比为lyg: 1 100 μ L。本发明将螨虫过敏原直接偶联在磁性微球表面，有利于去除血清中除螨虫过敏原特异性抗体之外的所有杂质，进行针对性的螨虫过敏原特异性抗体检测，缩短了检测时间， 提高了检测的灵敏度、特异性和准确性。本发明中制备的螨虫过敏原免疫磁性微球能应用于标准化自动检测，提高检测效率。
图1为实施例1羧基修饰的磁性微球的扫描电镜照片；图2为实施例3酶联免疫吸附检测OD值随免疫磁性微球加入量变化曲线。图3为实施例4酶联免疫吸附检测OD值随与血清中IgE浓度之间的变化关系图。
具体实施例方式实施例1使用常规的化学共沉淀法制备油酸钠包覆的!^e3O4磁流体用超纯水配制 0. 12mol/L 的氯化亚铁(FeCl2. 4H20)和 0. 2mol/L 的氯化铁(FeCl3. 6H20)各 25mL,转移到250mL三口烧瓶中，在氮气保护下搅拌，搅拌速度500rpm。将上述混合物温度升至 550C 15min后，迅速加入3mol/LNa0H，调节pH值到10-12。将混合物的温度升至65°C，维持转速搅拌40min。然后缓慢加入4%油酸钠50mL，将温度升至90°C，继续搅拌30min，冷却至室温，得到油酸钠包覆的!^e3O4磁流体。该磁流体的!^e3O4颗粒具有超顺磁性，平均粒径为 30_50nmo分散聚合法制备羧基修饰的磁性微球取4mL上述油酸钠包覆的!^e3O4磁流体均勻分散在IOmL超纯水、9g聚乙二醇6000 (PEG6000)、35mL乙醇的混合液中，超声分散30min ； 转移到三口烧瓶中，在氮气保护下搅拌，搅拌速度300rpm，通氮气30min以除去氧气，然后依次加入过氧化苯甲酰1. 6g、偶联剂二乙烯苯0. ImL和单体苯乙烯8mL、丙烯酸0. 8mL，继续搅拌30min。升温到75°C，反应持续10小时，聚合结束，将混合液冷却至室温。磁分离，用乙醇和超纯水反复洗涤，得到羧基修饰的磁性微球。然后离心分选，保存于含0.02% (w/v) 叠氮钠的去离子水中。上述过氧化苯甲酰经重结晶，单体均需经减压蒸馏去除阻聚剂后使用。该磁性微球粒径分布在500nm-2 μ m左右，约1 μ m，单分散性良好(图1)。实施例2偶联螨虫过敏原蛋白，制备免疫磁性微球。(1)使用25mM MES (pH = 6)为缓冲液，清洗磁性微球(浓度为10mg/mL)，清洗两次。用上述缓冲液溶解螨虫过敏原蛋白；(2)使用新鲜配制的EDC和NHS为交联剂，EDC和NHS的浓度为50mg/mL，向清洗后的磁性微球各加入一定体积的交联剂，每毫克磁性微球各加入20 μ L交联剂，室温下倾斜旋转孵育30min，活化磁性微球；(3)活化后的磁性微球用MES缓冲液清洗两次，然后加入适量螨虫过敏原蛋白(磁性微球与螨虫过敏原蛋白的质量比为15 1)，漩涡混合，室温下旋转孵育1- ;(4)清洗偶联抗体后的磁性微球，用0. 05M Tris. HCl (pH = 7. 4)阻断未反应的磁性微球表面的羧基，室温下旋转孵育15min，缓冲液清洗4次，此缓冲液为含0.5% (w/v) Tween-20 的 PBS (pH = 7.4)；(5) 牛血清白蛋白(BSA)溶液室温下震荡封闭24h ；(6)加入0.02% (w/v)的叠氮化钠长期保存。实施例3(1)免疫磁性微球的清洗活化取上述制备并保存的免疫磁性微球于干净的离心管中，按照体积比1 10的比例加入含0.1% BSA的PBS活化缓冲液，混勻。磁分离，移除缓冲液。如此再次清洗一次，然后加上述活化缓冲液定容至原需求量。(2)样品孵育取上述清洗活化后的免疫磁性微球(10mg/mL)0.2yL、0.5yL、 1 μ L、2y L、4y L，各与100 μ L标准螨虫血清样品在酶标板各孔中混合，轻轻摇勻，室温下振荡孵育15-20分钟。(3)洗板孵育结束后磁分离，保留上清于新的离心管待检测，每孔各加入200 μ L PBST缓冲液洗涤酶标板，磁分离后，移除上清，如此反复洗涤3次，最后将洗涤液完全移除干净。(4)每孔分别加入100 μ L已经配制好的HR酶联二抗溶液，吸打或者轻轻摇晃，与免疫磁性微球混勻，37°C温育45min。(5)洗板如步骤(3)操作。(6)每孔加入100 μ L TMB底物显色液，吸打或者轻轻摇晃，与免疫磁性微球混勻， 室温避光静置反应15-20min。(7)每孔分别加入100 μ L终止反应液。(8)使用标准酶标仪在450nm波长下测出每孔的吸光度值(OD值)。如表2所示，采用上述操作方法，每一试验结果都来自3个重复的平均值。随着免疫磁性微球用量的依次增多，OD值都有不同程度的依次升高，免疫磁性微球捕获后的上清中IgE的含量也依次减少。当用量为2μ 1时，上清中仍有50. 2%的IgE ；当用量上升为4 μ 1时，上清中有17. 1 %的IgE，但检测值超出酶标仪可准确测量的范围，故选用2 μ 1作为合适用量。实施例4户尘螨过敏原特异性IgE(SlgE)的检测。用上述实施例1制备的磁性微球偶联户尘螨过敏原蛋白，偶联方法同实施例2，每毫克磁性微球偶联20 μ g户尘螨过敏原蛋白，制成户尘螨过敏原免疫磁性微球，备用。(1)免疫磁性微球的清洗活化取上述户尘螨过敏原免疫磁性微球于干净的离心管中，按照体积比1 10的比例加入含0.1% BSA的PBS活化缓冲液，混勻。磁分离，移除缓冲液。如此再次清洗一次，然后加上述活化缓冲液定容至原需求量。(2)样品孵育取标准户尘螨血清样品稀释浓度为0. 035IU/mL、0. lIU/mL、 0. 35IU/mL、0. 7IU/mL、2. lIU/mL、3. 5IU/mL。将免疫磁性微球清洗两次，分别取2 μ L免疫磁性微球加到酶标板的各孔中，再各加入100 μ L上述浓度梯度的标准户尘螨血清样品，吸打混勻；室温下振荡孵育15-20min。(3)洗板磁分离，移除上清，每孔加入200 μ L PBST缓冲液洗涤酶标板，磁分离后，移除上清，如此反复洗涤3次，最后将洗涤液完全移除干净。(4)每孔分别加入100 μ L已经配制好的HR酶联二抗，吸打或者轻轻摇晃，与免疫磁性微球混勻，37 °C温育45min。(5)洗板如步骤(2)操作。(6)每孔加入100 μ L TMB底物显色液，吸打或者轻轻摇晃，与免疫磁性微球混勻， 室温避光静置反应15-20min。(7)每孔分别加入100 μ L终止反应液。(8)使用标准酶标仪在450nm波长下测出每孔的吸光度值(0D值)。(9)结果计算以标准溶液系列的吸光度值(0D值)对相应浓度进行线性回归，获得剂量反应曲线。如图3所示，标准曲线在IgE浓度为0. 035IU/mL 3. 5IU/mL之间线性关系良好， R2 = O. 9874，相关系数良好。
权利要求
1.一种检测血清中螨虫过敏原特异性抗体的方法，包括将螨虫过敏原与表面羧基修饰的磁性微球偶联，制得免疫磁性微球；将待测血清与免疫磁性微球置于酶标板的孔内混合孵育，使螨虫过敏原与血清中螨虫过敏原特异性IgE结合，洗板后采用酶联免疫吸附法进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米磁性微球的制备方法为(1)将!^eCl2溶液和!^Cl3溶液混合，在氮气保护下搅拌，升温至50 60°C，保持10 20min，调节pH值到10 12，升温至60 70°C，搅拌30 60min，加入重量浓度为1 10%的油酸钠溶液，升温至90 100°C，搅拌，制得油酸钠包覆的Fii3O4磁流体；(2)将油酸钠包覆的!^e3O4磁流体聚乙二醇、乙醇和水均勻混合，在氮气保护下搅拌， 依次加入过氧化苯甲酰、二乙烯苯和单体苯乙烯、丙烯酸，搅拌30 60min。升温到70 80°C，保持10小时以上，分离，洗涤。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每毫克磁性微球偶联IOyg IOOyg螨虫过敏原。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磁性微球与螨虫过敏原偶联前磁性微球需经交联剂活化。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫磁性微球与待测血清的重量体积比为Iyg ι loo μ L。
全文摘要
本发明公开了一种检测血清中螨虫过敏原特异性抗体的方法，包括将螨虫过敏原与表面羧基修饰的磁性微球偶联，制得免疫磁性微球；将待测血清与免疫磁性微球置于酶标板的孔内混合孵育，使螨虫过敏原与血清中螨虫过敏原特异性IgE结合，洗板后采用酶联免疫吸附法进行检测。本发明将螨虫过敏原直接偶联在磁性微球表面，有利于去除血清中除螨虫过敏原特异性抗体之外的所有杂质，进行针对性的螨虫过敏原特异性抗体检测，缩短了检测时间，提高了检测的灵敏度、特异性和准确性。本发明中制备的螨虫过敏原免疫磁性微球能应用于标准化自动检测，提高检测效率。
文档编号G01N33/543GK102331492SQ20111015870
公开日2012年1月25日 申请日期2011年6月14日 优先权日2011年6月14日
发明者吴善东, 楼兵干, 赵铖铖, 高其康 申请人:浙江大学