专利名称：替加环素用于治疗癌症的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗癌症的方法和组合物，尤其涉及包含替加环素以用于治疗白血病的方法和组合物,所述白血病例如急性髓性白血病(AML )。
背景技术：
癌症干细胞目前癌症治疗最有挑战性的方法可能即癌症干细胞(CSC)。在1961年首次由Till和McCulloch1描述了干细胞，通常通过干细胞自我更新和分化成各种细胞类型的能力的潜力对其进行定义。据信，包括少部分肿瘤的癌症干细胞具有开始和支持肿瘤发生过程的能力。在治疗过程中难以根除它们，因此它们已经成为癌症治疗的引人兴趣的目标。用于癌症干细胞假说的很多证据来自恶性血液病的研究。Dick和同事进行的研究2在来自急性髓性白血病(AML)患者的外周血的小隔室(compartment)中发现了白血病干细胞(LSC)。然后他们得以将这些LSC成功地移植到非肥胖糖尿病重症联合免疫缺陷(NOD-SCID)小鼠的骨髓，在该处，这些人细胞增殖并且所散布的表型类似于原患者中的表型。因此，LSC的当前功能标准为向NOD-SCID小鼠中的成功移植。尽管LSC具有自我更新和分化的能力，证据表明，在静止GO期中发现大量LSC3。这可能是化学疗法无法去除LSC的原因，因为化学疗法通常靶向处于快速周期中的细胞群。LSC抗药物和毒素的其它原因可能是ATP相关转运体的表达4和对细胞凋亡刺激的抗性5。因此，发现将直接作用于白血病干细胞存活力的新的治疗性化合物，可能是有益的。
发明内容
本发明的一个方面包括在癌细胞中诱导细胞毒性的方法，所述方法包括使所述细胞接触甘氨酰环素。本发明的另一个方面包括治疗癌症的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的甘氨酰环素，例如替加环素。本发明的另一个方面包括甘氨酰环素用于治疗癌症的用途，所述甘氨酰环素例如替加环素。在一个实施方式中，所述甘氨酰环素包括替加环素。在一个实施方式中，所述癌症为血液癌症或实体癌。在一个实施方式中，所述血液癌症为白血病。在另一个实施方式中，所述白血病为急性髓性白血病(AML)。出于下述详细表述，本发明的其它特征和优点将变得显而易见。然而，应该理解，所述详细描述和具体实施例尽管指明了本发明的优选实施方式，但是其仅通过示例的方式给出，其原因在于，出于此详细描述，在本发明的精神和范围内的各种改变和修饰对于本领域技术人员来说是显而易见的。附图
简沭现将关于附图描述本发明的实施方式，其中图I. TEX和M9-ENL-1细胞中的筛选鉴定了具有新的抗白血病活性的替加环素。(A)将TEX和(B)M9-ENL1细胞铺板于96孔板中，然后将药物加入孔中(5 μ I /孔)，最终浓度为10 μ M (示出)和I μΜ。在48小时(M9-ENL-1)和72小时(TEX)通过MTS测定测量细胞生长和存活力。以占单独用DMSO治疗的细胞的百分比示出了每种化合物的细胞存活力。将(C)白血病、(D)骨髓瘤、和(E)实体瘤细胞系接种于96孔板中，然后用浓度渐增的替加环素处理。在72小时通过MTS测定测量细胞生长和存活力。将细胞存活力表示为相对于经溶媒处理的细胞的百分比平均值加或减SD (η = 3)。(F)通过流式细胞术以膜联蛋白V标记的细胞的百分比进行测定，替加环素在TEX细胞中显示了细胞凋亡的时间 依赖性的增加。(G)将TEX细胞接种于96孔板中，然后用浓度渐增的替加环素、米诺环素和四环素处理。在72小时通过MTS测定测量细胞存活力。将细胞存活力表示为相对于经溶媒处理的细胞的百分比平均值加或减SD (η = 3)。图2.替加环素诱导细胞死亡并且优先于正常造血细胞抑制原代AML细胞的族群性生长。用浓度渐增的替加环素处理来自白血病患者外周血的单核细胞(母细胞计数>80%)和正常G-CSF发展供体48小时。通过膜联蛋白-PI流式细胞术染色测量细胞存活力。将细胞存活力表示为相对于经DMSO处理的细胞的百分比平均值加或减SD (η = 3)。将来自原代AML患者样品的单核细胞(Α、B)和正常外周血细胞(C)铺板于具有5 μ M替加环素的甲基纤维素中。(D)在铺板后7天(AML)和14天(正常)对集落形成单元进行计数。相比于经DMSO处理的所铺细胞表示集落形成百分比。图3.替加环素具有体内抗白血病活性。(Α、Β)将人白血病(0CI-AML2)皮下注射到SCID小鼠的侧腹中。注射后7天，当可摸出肿瘤时，用替加环素(每天2次腹膜内注射50mg/kg或100 mg/kg)或溶媒对照治疗小鼠(n = 10只/组)。细胞注射后14天,处死小鼠，切除肿瘤，测量肿瘤的体积和质量。示出了肿瘤质量和体积平均值+ SD0通过非成对t检验* p〈0. 001分析肿瘤体积和质量的差异。(C)治疗5天后，从2只对照小鼠和3只经替加环素处理的小鼠中切出肿瘤，提取总蛋白，然后通过蛋白质印记分析Cox-1、Cox-2、Cox-4、和微管蛋白。(D)将来自3位AML患者的原代细胞经股内注射到经亚致死剂量辐照的雌性N0D/SCID小鼠的右侧股骨中。注射后3周，用替加环素(通过每天腹膜内注射100 mg/kg)或溶媒对照(η = 10 /组)治疗小鼠3周。治疗之后，通过FACS分析测量经注射的右侧股骨中的人白血病细胞移植的人CD45+CD19 —CD33+细胞。数据表示被移植的人细胞的平均值土 SD。将来自一个患者实验的细胞用于评估第二代N0D/SCID小鼠的第二次移植。将相等数量的来自对照和经替加环素处理小鼠的骨髓的活白血病细胞注射到经辐照的N0D/SCID小鼠中，所述小鼠未用替加环素处理。6周之后，通过FACS分析测量经注射的右侧股骨中的人白血病细胞移植的人CD45+CD19 —CD33+细胞。(氺ρ〈 O. 005, Student t检验)。图4.替加环素降低TEX细胞中的线粒体Cox-I蛋白水平。(A)用浓度渐增(2. 5μ M和5 μ Μ)的替加环素处理来自TEX、0CI-AML2和2位原代AML患者的细胞，并进行替加环素的36和48小时。提取总蛋白，然后通过蛋白质印记分析Cox-1、Cox-2、Cox-4>grp78、XIAP、肌动蛋白和微管蛋白。(B)用浓度渐增(2. 5 μ M和5 μ Μ)的替加环素处理TEX和AML患者细胞。通过定量RT-PCR测定相对18S的Cox-l、Cox_2、和Cox_4 mRNA表达。数据以平均值土 SD表示。(C)用浓度渐增的替加环素和氯四环素(CAP)处理TEX细胞72小时。如“材料和方法”中所述测定相对于柠檬酸合酶活性的复合物Ι、Π和IV酶活性。(D)用浓度渐增的替加环素处理来自ΤΕΧ、原代AML患者、和正常供体的细胞。通过用JC-染料对细胞进行染色和流式细胞术分析(红/绿比率)测定线粒体膜电势(Λ ψ )。通过用h2-DCFDA和Dihydroethidium (DHE)染色测定活性氧物质产生(R0S)。图5.急性髓性白血病细胞的线粒体特征。(A)测定来自原代AML和正常的经G-CSF动员供体的外周血的单核细胞中线粒体DNA拷贝数。从细胞中提取DNA，以及进行线粒体NDl相对于人球蛋白(HGB)的实时PCR。示出了相对于来自一个正常的经G-CSF动员供体的细胞的ND1/HGB比率。(B)评估AML大量母细胞和⑶45+/⑶34+细胞中的线粒 体质量，并与来自正常的经G-CSF动员个体的⑶45+/⑶34+细胞进行比较。通过将细胞与Mitotracker Green FM染料一起孵育、以及进行流式细胞术来测量线粒体质量。示出了相对于一个正常的经G-CSF动员供体的中位荧光强度。(C)使用Mitotracker Green FM方法测量来自11位AML患者的母细胞中的线粒体质量。然后将细胞与浓度渐增的替加环素一起孵育48小时。通过膜联蛋白-V/PI染色和之后的流式细胞术评估存活力。示出了基线线粒体质量与对剂量为5 μ M和10 μ M的替加环素的敏感性之间的相关性。
具体实施例方式I.定义如本文使用的术语“甘氨酰环素”表示任何四环素的任何甘氨酰基衍生物，例如叔-丁基-甘氨酰基酰胺基衍生物，并包括任何盐形式，例如它们的任何药学上可接受的盐、对映体、立体异构体、溶剂化物、前药或混合物。例如，参见6’7。在一个实施方式中，所述甘氨酰基衍生物为四环素，其中甘氨酰基连接在四环结构的第9位处。如本文使用的“甘氨酰基”表示下式的基团
O R'其中R’和R〃独立地选自基团H、C1,烷基、C6,芳基和C3_1(l环烷基，或R’和R〃相连接从而与它们连接的氮在一起形成3至10元环。在一个实施方式中，R’和R"中的一者为H，R’和R"中的另一者为CV6烷基(分支的或不分支的)。如本文使用的术语“替加环素”表示具有以下结构的化合物
权利要求
1.一种在癌细胞中诱导细胞毒性的方法，所述方法包括使所述癌细胞接触甘氨酰环素。
2.根据权利要求I所述的方法，其用于治疗癌症，其中所述癌细胞在受试者中，并且给所述受试者施用有效量的甘氨酰环素。
3.甘氨酰环素用于治疗癌症的用途。
4.一种甘氨酰环素化合物，其用于治疗癌症。
5.一种根据权利要求2所述的治疗癌症的方法，所述方法包括a)从受试者获得测试样品山)测定所述测试样品的线粒体DNA拷贝数和/或线粒体质量；c)将所述测试样品的线粒体DNA拷贝数和/或线粒体质量与对照的线粒体DNA拷贝数和/或线粒体质量比较，以及d)当与所述对照的线粒体DNA拷贝数和/或线粒体质量相比，所述测试样品的线粒体DNA拷贝数和/或线粒体质量增加至少2倍时，给所述受试者施用甘氨酰环素。
6.根据权利要求3所述的甘氨酰环素用于治疗癌症的用途，与对照相比，所述癌症的线粒体DNA拷贝数和/或线粒体质量增加至少2倍。
7.根据权利要求I或2所述的方法、根据权利要求3所述的用途或根据权利要求4所述的化合物，其中所述甘氨酰环素为替加环素。
8.根据权利要求I至7中任一项所述的方法、用途或化合物，其中所述癌细胞在体内。
9.根据权利要求I至8中任一项所述的方法、用途或化合物，其中所述癌症为血液癌症，或者所述癌细胞为血液癌细胞。
10.根据权利要求9所述的方法、用途或化合物，其中所述血液癌症为白血病、淋巴瘤或骨髓瘤，或者所述癌细胞为白血病细胞、淋巴瘤细胞或骨髓瘤细胞。
11.根据权利要求10所述的方法、用途或化合物，其中所述白血病为AML、ALL、CLL或CML,或者所述白血病细胞为AML细胞、ALL细胞、CLL细胞或CML细胞。
12.根据权利要求I至11中任一项所述的方法、用途或化合物，其中所述癌症为实体瘤癌症，或者所述癌细胞为实体瘤癌细胞。
13.根据权利要求12所述的方法、用途或化合物，其中所述实体瘤癌症为肺癌、卵巢癌或前列腺癌，或者所述癌细胞为肺癌细胞、卵巢癌细胞或前列腺癌细胞。
14.根据权利要求I至13中任一项所述的方法、用途或化合物，其中所述施用的甘氨酰环素被包含在组合物、剂量或剂型中，所述甘氨酰环素例如替加环素。
15.根据权利要求14所述的方法、用途或化合物，其中所述组合物包含有效量的甘氨酰环素和任选的合适的载体或介质。
16.根据权利要求15所述的方法、用途或化合物，其中所述组合物为药物组合物。
17.根据权利要求16所述的方法、用途或化合物，其中所述药物组合物的剂型选自固体剂型和液体剂型。
18.根据权利要求17所述的方法、用途或化合物，其中所述组合物通过胃肠外、静脉内、皮下、肌肉内、颅骨内、眶内、眼内、心室内、囊内、脊柱内、脑池内、腹膜内、鼻内、喷雾或口服给药施用。
19.根据权利要求18所述的方法、用途或化合物，其中所述组合物包括可注射剂型。
20.根据权利要求17所述的方法、用途或化合物，其中所述组合物通过肿瘤内注射或肿瘤内血管系统注射施用。
21.根据权利要求17所述的方法、用途或化合物，其中每个单位剂型包含约100mg至约 2000 mg、约 100 mg 至约 1500 mg、约 100 mg 至约 1000 mg、约 100 mg 至约 700 mg、约100 mg 至约 500 mg、约 100 mg 至约 350 mg、约 100 mg 至约 300 mg 或约 100 mg 至约 250mg的甘氨酰环素，例如替加环素。
22.根据权利要求17所述的方法、用途或化合物，其中每个单位剂型包含约20至约100mg的甘氨酰环素/kg受试者体重、约30至约100 mg的甘氨酰环素/kg受试者体重、约40至约100 mg的甘氨酰环素/kg受试者体重、或约50至约100 mg的甘氨酰环素/kg受试者体重，所述受试者需要配制成固体口服剂型、液体口服剂型或可注射剂型的此治疗剂。
23.一种鉴别可能受益于甘氨酰环素给药的受试者的方法，所述方法包括 从受试者获得测试样品； 测定所述测试样品的线粒体DNA拷贝数和/或线粒体质量；和 将所述测试样品的线粒体DNA拷贝数和/或线粒体质量与对照的线粒体DNA拷贝数和/或线粒体质量比较， 其中当与所述对照相比，所述癌细胞的线粒体DNA拷贝数和/或线粒体质量增加至少2倍时，所述受试者被鉴别为可能受益于甘氨酰环素给药。
24.一种试剂盒，其包括用于根据权利要求I至23中任一项所述的方法、用途或化合物的甘氨酰环素和说明和/或包装物。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述甘氨酰环素为替加环素。
全文摘要
癌症干细胞显示出与其它癌细胞不同的代谢谱，使得它们不易于对使用常规化学治疗剂的治疗反应。本文公开的研究现在证明，甘氨酰环素抗生素替加环素(四环素衍生物)显示出抗癌活性，包括抗癌症干细胞的活性。这种抗瘤活性看起来是由抑制癌细胞中的线粒体蛋白合成导致的。在优选实施方案中，待治疗癌症是血液癌症，例如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
文档编号G01N33/48GK102821769SQ201180013184
公开日2012年12月12日 申请日期2011年3月10日 优先权日2010年3月10日
发明者A·D·希梅尔, M·斯克提克 申请人:大学健康网络