专利名称：荧光增白剂cbs-x检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种添加剂检测技术，具体来说，特别是涉及一种用于荧光增白剂CBS-X含量的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
荧光增白剂0851，化学名称为4，4/ -双(2_磺酸钠苯乙烯基)联苯，属双二苯乙烯-联苯型光学增白剂，特点是增白强度高，耐氯漂，氧漂性能优良，具有优异的耐洗牢度和干、湿日晒度，匀染性能良好，适合用于洗涤用品，也可直接用于纺织品、纸张的光学增白。长期以来，荧光增白剂的安全性颇受争议，有资料显示荧光增白剂是低毒的，也有 资料显示荧光增白剂的分子结构稳定，不易被分解，在生物体内长期累积，会使细胞发生变异，产生潜在的致癌因素。因此，在未充分评估荧光增白剂的安全性的情况下，并不是所有荧光增白剂都被允许使用，欧盟、美国、日本、中国等许多国家对荧光增白剂都有一定的监管，相关法规如欧盟2002/72/EC指令、美国联邦法规21CFR178. 3297和GB 9685-2008《食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准》都制定了允许用于生产塑料食品接触材料和制品的添加剂清单，对允许使用的荧光增白剂的最大添加量进行限制。鉴于此，建立相关产品的荧光增白剂的快速检测方法，开展定期监测和安全性评估，对于规范行业发展，保证产品质量，保护消费者身体健康和保护环境等具有深远的意义。而荧光增白剂CBS-X做为允许添加的荧光增白剂中的一种，也亟需一种合适的快速检测方法。目前，国内外对荧光增白剂的检测方法包括以下几种紫外灯直接照射观测法、色谱法、色谱质谱联用法。其中，紫外灯直接照射观测法只是一种简单的判断，不能鉴别荧光增白剂的种类；色谱法和色谱质谱联用法具有特异性高、结果准确的优点，但是这两种方法的缺点是样品前处理繁琐，消耗大量溶剂，且需要昂贵的实验室设备，检测成本高。
发明内容
基于此，本发明在于克服现有技术的缺陷，提供一种荧光增白剂CBS-X检测试剂盒和一种荧光增白剂CBS-X试剂盒制备方法，该试剂盒在检测荧光增白剂CBS-X时可一次连续检测多个样品，具有便捷，快速，灵敏、成本低的特点。本发明的第一个目的在于提供一种突光增白剂CBS-X检测试剂盒,其技术方案如下一种荧光增白剂CBS-X检测试剂盒，主要包括I)包被荧光增白剂CBS-X特异性抗原的酶标板所述酶标板的每个微孔内荧光增白剂CBS-X特异性抗原的浓度为1-3 μ g/mL ；2)荧光增白剂CBS-X特异性抗体溶液该荧光增白剂CBS-X特异性抗体的浓度为
1-3 μ g/mL ；所述荧光增白剂CBS-X特异性抗原与荧光增白剂CBS-X特异性抗体溶液的用量比为 I :1。
在其中一个实施例中，所述荧光增白剂CBS-X检测试剂盒还包括有酶标二抗，所述酶标二抗是浓度按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗。在其中一个实施例中，所述荧光增白剂CBS-X特异性抗原的浓度为2μ g/mL ;所述荧光增白剂CBS-X特异性抗体的浓度为2 μ g/mL。在其中一个实施例中，所述荧光增白剂CBS-X检测试剂盒还包括荧光增白剂CBS-X标准品溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液、封闭液和浓缩样品稀释液。在其中一个实施例中，所述特异性荧光增白剂CBS-X特异性抗体是鼠源单克隆抗体；所述荧光增白剂CBS-X特异性抗原为荧光增白剂CBS-X与载体蛋白的偶联物；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白、甲状腺球蛋白中的一种；所述荧光增白剂 CBS-X 标准品溶液浓度分别为 I X IO5 μ g/L, I X IO4 μ g/L, I X IO3 μ g/L, I X IO2 μ g/L,IXIOiU g/L、I X 10° μ g/L ;所述显色剂由显色剂A和显色剂B组成，所述显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，所述显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述终止液为l-2mol/L的硫酸 溶液；所述洗涤液为含有O. 05%-0. 5%吐温-20的O. 01M，pH7. 4的磷酸盐缓冲液；所述封闭液为含5%脱脂奶粉的O. 01M，pH7. 4的磷酸盐缓冲液；所述浓缩样品稀释液为O. 01M，pH7. 4的磷酸盐缓冲液；所述酶标板的材料为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的一种。本发明的第二个目的在于提供一种荧光增白剂CBS-X检测试剂盒制备方法，主要包括以下步骤I)制备包被荧光增白剂CBS-X特异性抗原的酶标板将2-磺酸基苯甲醛、2-磺酸基-5羟基-苯甲醛和荧光增白剂CBS-X分散于干燥DMSO中，加入哌啶，微波加热，反应结束倒入水中，抽滤固体，得到带有酚羟基的荧光增白剂CBS-X衍生物；将带酚羟基的荧光增白剂CBS-X衍生物和碳酸钾分散于干燥DMF中，常温搅拌，加入N- (3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯，加热回流，荧光增白剂CBS-X的酚羟基被叔丁氧酰胺丙氧基所取代；随后将中间产物加入三氟乙酸中，回流搅拌，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的荧光增白剂CBS-X的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺(NHS)和碳二亚胺(EDC)混合后反应，与载体蛋白偶联制备得到荧光增白剂CBS-X特异性抗原，将荧光增白剂CBS-X特异性抗原包被于酶标板中，所述酶标板的每个微孔内荧光增白剂CBS-X特异性抗原的浓度为
1-3 μ g/mL ；2)制备荧光增白剂CBS-X特异性抗体以步骤I)中合成的荧光增白剂CBS-X特异性抗原作为免疫原对小鼠进行免疫；免疫后，取血清效价高的小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的荧光增白剂CBS-X单克隆抗体；所述荧光增白剂CBS-X特异性抗体的浓度为1-3 μ g/mL。在其中一个实施例中，上述步骤I)中，制备荧光增白剂CBS-X特异性抗原的方法优选为将O. 186g,即I. Ommol的2-磺酸基苯甲醒、O. 20g,即I. Ommol的2-磺酸基_5轻基-苯甲醛和O. 40g,即I. Ommol的荧光增白剂CBS-X分散于30mL干燥DMSO中，加入哌啶3mL，微波500瓦加热5min，反应结束倒入水中，抽滤固体，得到带有酚羟基的荧光增白剂CBS-X衍生物；将O. 53g，即I. Ommol的带酚羟基的荧光增白剂CBS-X衍生物和I. Olg,即IOmmol的碳酸钾分散于80mL干燥DMF中，常温搅拌30min,加入I. 2g,即5mmol的N- (3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯，加热回流5h，荧光增白剂CBS-X的酚羟基被叔丁氧酰胺丙氧基所取代；随后将中间产物加入30倍的三氟乙酸(TFA)中，回流搅拌lh，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的荧光增白剂CBS-X的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合后反应，与牛血清白蛋白偶联制备得到荧光增白剂CBS-X特异性抗原。在其中一个实施例中，上述步骤2)为以步骤I)中合成的荧光增白剂CBS-X特异性抗原作为免疫原对10周龄的Ba lb/c小鼠进行免疫，首次免疫使用完全弗氏佐剂与荧光增白剂CBS-X特异性抗原溶液乳化，抗原浓度为O. 5mg/mL，剂量为100 μ g/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与荧光增白剂CBS-X特异性抗原溶液乳化，剂量同初次免疫；初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次,共免疫8-10次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫；最后一次不加免疫佐剂直接用荧光增白剂CBS-X特异性抗原水溶液直接腹腔注射，剂量同初次免疫；尾部取血检测血清效价；取血清效价高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并Balb/C小鼠，于一周 前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为O. 5mL/只；将细胞浓度为I. 5万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为O. 5mL/只；接种杂交瘤细胞6-10天后，收集腹水，反复收集数次；存于4°C冰箱保存；经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的荧光增白剂CBS-X单克隆抗体。本发明的荧光增白剂CBS-X检测原理为将荧光增白剂CBS-X特异性抗原吸附于固相载体上，加入样品或荧光增白剂CBS-X的标准溶液及荧光增白剂CBS-X特异性抗体工作液，待测样品中荧光增白剂CBS-X和固相载体上包被的荧光增白剂CBS-X特异性抗原竞争结合荧光增白剂CBS-X特异性抗体，孵育后，加入酶标二抗进行酶活性的放大作用，孵育，显色后终止，测定样品的吸光度，该值与样品中荧光增白剂CBS-X的量呈负相关，与标准曲线比较即可得出荧光增白剂CBS-X浓度范围。下面对前述技术方案的优点进行说明本发明的荧光增白剂CBS-X检测试剂盒，利用竞争酶联免疫测定法检测荧光增白剂CBS-X，具有特异性高，结果准确且前处理简单，对仪器设备要求低、检测成本低的特点。同时，本试剂盒中的试剂以工作液形式提供，操作简单、快捷，为使用者节省了时间并减少因步骤复杂造成的误差。适合用于快速而准确得检测大批量样品中的荧光增白剂CBS-X。
具体实施例方式下面对本发明的实施例进行详细说明，但不对本发明的内容造成任何限制。实施例I本实施例所述的荧光增白剂CBS-X检测试剂盒的主要组成成份如下I)荧光增白剂CBS-X特异性抗原工作液；通过以下方法制得将O. 186g,即I. Ommol的2_磺酸基苯甲醒、O. 20g,即I. OmmoI的2-磺酸基-5羟基-苯甲醛和O. 40g,即I. Ommol的荧光增白剂CBS-X分散于30mL干燥DMSO中，加入哌啶3mL，微波500瓦加热5min，反应结束倒入水中，抽滤固体，得到带有酚羟基的荧光增白剂CBS-X衍生物；将O. 53g，即I. Ommo I的带酚羟基的荧光增白剂CBS-X衍生物和I. Olg,即IOmmol的碳酸钾分散于8OmL干燥DMF中,常温搅拌30min,加入I. 2g,即5mmol的N- (3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯，加热回流5h,突光增白剂CBS-X的酹轻基被叔丁氧酰胺丙氧基所取代；随后将中间产物加入30倍的三氟乙酸(TFA)中，回流搅拌lh，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的荧光增白剂CBS-X的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺(NHS)和碳二亚胺(EDC)混合，与牛血清白蛋白混合，室温搅拌lh，偶联制备荧光增白剂CBS-X特异性抗原，并用浓缩样品稀释液稀释至浓度为2 μ g/mL。2)荧光增白剂CBS-X特异性抗体工作液；通过以下方法制得将合成得到的荧光增白剂CBS-X特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫。首次免疫使用完全弗氏佐剂与荧光增白剂CBS-X特异性抗原的O. 01M，pH7. 4的磷酸盐缓冲液乳化，抗原浓度为O. 5mg/mL，剂量为100 μ g/只，以后每 次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与荧光增白剂CBS-X特异性抗原的O. 01M，pH7. 4的磷酸盐缓冲液乳化，剂量同初次免疫。初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫8-10次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫。最后一次不加免疫佐剂直接用荧光增白剂CBS-X特异性抗原的O. 01M, pH7. 4的磷酸盐缓冲液直接腹腔注射，剂量同初次免疫。尾部取血检测血清效价。取血清效价高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株。单克隆抗体的制备与纯化Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为O. 5mL/只。将细胞浓度为I. 5万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为O. 5mL/只。接种杂交瘤细胞6-10天后，收集腹水，反复收集数次。存于4 °C冰箱保存。经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化。具体方法每I份腹水中加入3份乙酸钠缓冲液(浓度 O. 05mol/L, ρΗ4· 0)，用浓度 O. lmmol/L NaOH 调整 pH 至 4. 5，在 4°C下搅拌 30min，期间缓慢加入辛酸，按稀释前腹水体积计算40 μ L/mL ;在4 静止3h,离心(10140r/min, 30min),取上清液，保持在4°C环境中，30min内加入(NH4) 2S04使终浓度为O. 277g/mL,静止lh，4V离心(10140r/min, 30min),弃上清液,得到单克隆抗体沉淀，并用浓缩样品稀释液稀释至浓度为 2 μ g/mL。3)辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗；由商业公司提供的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗；4)荧光增白剂CBS-X标准品溶液6瓶；浓度分别为IX IO5 μ g/L、I X IO4 μ g/L、I X IO3 μ g/L、I X IO2 μ g/L、IXlO1U g/L、
IX 10° μ g/L ；5)酶标板；96孔聚苯乙烯酶标板，由商业公司提供；6)底物显色剂；由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为浓度为30%的过氧化氢水溶液，显色剂B为浓度为10mg/mL的四甲基联苯胺DMSO溶液；7)洗涤液；为含有重量比为(λ 05%-0. 5%吐温-20的(λ 01M, pH7. 4的磷酸盐缓冲液；
8)终止液；为2mol/L的硫酸溶液；9)封闭液；为含5%脱脂奶粉的O. 01M, pH7. 4的磷酸盐缓冲液；10)浓缩样品稀释液；为O. 01M，pH7. 4的磷酸盐缓冲液(即磷酸根浓度为O. 01M/L，pH 7. 4的磷酸盐缓冲液)；11)自封袋；
由商业公司提供。实施例2间接竞争ELISA方法的建立。采用间接竞争ELISA法检测荧光增白剂CBS-X单克隆抗体的竞争抑制率，方法如下I)用2 μ g/mL的荧光增白剂CBS-X特异性抗原包被96孔酶标板，100 μ L/孔，放置于4°C冰箱包被过夜，用250yL/孔封闭液(即5%脱脂奶粉)封闭后用洗涤液洗涤，并拍干;2)加入荧光增白剂CBS-X标准品溶液(浓度分别为1Χ105 μ g/L、I X IO4 μ g/L、
1X IO3 μ g/L、I X IO2 μ g/L、I X IO1 μ g/L、I X 10° μ g/L)或样品溶液 50 μ L，再加入浓度为
2μ g/mL的荧光增白剂CBS-X特异性抗体工作液50 μ L，混合均匀，37°C温育Ih ；3)洗涤拍干后，加入用稀释液按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗工作液，100 μ L/孔，37°C温育Ih ；4)洗漆拍干，每孔加入50 μ L显色液B液、10 μ L显色液A液显色15mi η,加入浓度为2mol/L的硫酸溶液，50 μ L/孔，终止反应，设定酶标仪于450nm处(优选用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定OD值。以抑制率1%为纵坐标，以荧光增白剂CBS-X浓度的对数Ig[荧光增白剂CBS-X (ng/mL)]为横坐标，绘制荧光增白剂CBS-X竞争抑制曲线。将样品的抑制率代入标准曲线回归方程，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中荧光增白剂CBS-X的实际含量。抑制率计算公式如下I =-— X I 00%
B, - Bs其中1-抑制率B——(样本溶液的平均吸光度值)B0——(O μ g/L标准溶液的平均吸光度值)Bn——(参比空白对照平均吸光度值)实施例3试剂盒灵敏度、特异性、准确度。I.灵敏度测定。利用实施例2的间接竞争ELISA法测定结果建立荧光增白剂CBS-X检测的标准工作曲线。荧光增白剂CBS-X单克隆抗体在I μ g/L IX 105μ g/L范围内有良好的线性，IC 50=905. Ing/mL,最低检测限为O. 553ng/mL,检测范围(抑制20% 80%之间)为4. 714ng/mL 1520. 113 μ g/mL。纸和塑料制品的检测限为O. 277ng/cm2，食品样品的检测限为
O.277ng/g,日化产品的检测限为50ng/g。2.特异性测定。采用实施例2的间接竞争ELISA法测定荧光增白剂CBS-X结构类似物(联二苯、2-乙烯基苯磺酸钠盐、2-苯乙烯苯磺酸钠盐、2-联二苯乙烯基苯磺酸钠盐)与单抗混合物的交叉反应。将系列浓度(1Χ107μ g/L、lX10V g/L、lX105y g/L、lX104y g/L、
IX IO3 μ g/L、I X IO2 μ g/L、I X IO1 μ g/L)的上述物质分别与抗体同时加入到已包被封闭好的酶标板中，具体步骤同实施例2，分别计算各类似物的抑制率。利用单克隆抗体对荧光增白剂CBS-X的IC5tl值与单克隆抗体对各类似物的IC5tl值的比值得到交叉反应率(CR%)，公 式如下
类似物的IC5()值结果表明荧光增白剂CBS-X单克隆抗体与联二苯、2-乙烯基苯磺酸钠盐、2-苯乙烯苯磺酸钠盐、2-联二苯乙烯基苯磺酸钠盐的交叉反应率均检测不到具体数值，为少于
O.05%。3.准确度测定。向空白纸制品、塑料制品和食品样品中添加O. I μ g/mL和10 μ g/mL的突光增白剂CBS-X,日用产品样品中添加100μ g/mL和1000 μ g/mL的荧光增白剂CBS-X，重复三次，每次做三个平行，采用实施例2的间接竞争ELISA法测定抑制率，然后将抑制率(三个平行的平均值)代入标准曲线回归方程，算出含量，并计算回收率。回收率公式如下
回收率=f§§xioo%
添加值结果表明纸制品的回收率为87. 5% 103. 2%，塑料制品的回收率为90. 5% 99. 7%，食品的回收率为87. 5% 98. 2%,日用产品的回收率为86. 5% 95. 8%。实施例4检测纸样品中的荧光增白剂CBS-X的迁移。I.样品的前处理。将纸制品测得面积后，按每平方厘米2mL的量注入蒸馏水，或采用全部浸泡的方法，其面积以纸制品的二面计算，在室温(>20°C)浸泡2h后，取50 μ L进行分析。2.间接竞争ELISA法检测样品中荧光增白剂CBS-X的残留。采用实施例2的方法进行检测，根据测定结果，计算出抑制率，代入标准曲线方程求出荧光增白剂CBS-X的含量，见下表I。表I纸制品中荧光增白剂CBS-X的迁移量。
权利要求
1.一种荧光增白剂CBS-X检测试剂盒，其特征在于，主要包括 1)包被荧光增白剂CBS-X特异性抗原的酶标板所述酶标板的每个微孔内荧光增白剂CBS-X特异性抗原的浓度为1-3 u g/mL ； 2)荧光增白剂CBS-X特异性抗体溶液该荧光增白剂CBS-X特异性抗体的浓度为1-3u g/mL ； 所述荧光增白剂CBS-X特异性抗原与荧光增白剂CBS-X特异性抗体溶液的用量比为I :Io
2.根据权利要求I所述的荧光增白剂CBS-X检测试剂盒，其特征在于，还包括有酶标二抗，所述酶标二抗是浓度按1:10000比例稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗。
3.根据权利要求I或2所述的荧光增白剂CBS-X检测试剂盒，其特征在于，所述荧光增白剂CBS-X特异性抗原的浓度为2 u g/mL ;所述荧光增白剂CBS-X特异性抗体的浓度为2u g/mL。
4.根据权利要求I所述的荧光增白剂CBS-X检测试剂盒，其特征在于，还包括荧光增白剂CBS-X标准品溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液、封闭液和浓缩样品稀释液。
5.根据权利要求4所述的荧光增白剂CBS-X检测试剂盒，其特征在于，所述荧光增白剂CBS-X特异性抗体是鼠源单克隆抗体；所述荧光增白剂CBS-X特异性抗原为荧光增白剂CBS-X与载体蛋白的偶联物；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白、甲状腺球蛋白中的一种；所述荧光增白剂CBS-X标准品溶液浓度分别为IX 105y g/L、IXlO4U g/L、IXlO3U g/L、IXlO2U g/L、IXlO1U g/L、I X IO0 u g/L ;所述显色剂由显色剂 A和显色剂B组成，所述显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，所述显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述终止液为l-2mol/L的硫酸溶液；所述洗涤液为含有0. 05%-0. 5%吐温-20的0.01M, pH7. 4的磷酸盐缓冲液；所述封闭液为含5%脱脂奶粉的0. 1M，pH7. 4的磷酸盐缓冲液；所述浓缩样品稀释液为.01M, pH7. 4的磷酸盐缓冲液；所述酶标板的材料为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的一种。
6.一种荧光增白剂CBS-X检测试剂盒制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤 1)制备包被荧光增白剂CBS-X特异性抗原的酶标板将2-磺酸基苯甲醛、2-磺酸基-5羟基-苯甲醛和荧光增白剂CBS-X分散于干燥DMSO中，加入哌啶，微波加热，反应结束倒入水中，抽滤固体，得到带有酚羟基的荧光增白剂CBS-X衍生物；将带酚羟基的荧光增白剂CBS-X衍生物和碳酸钾分散于干燥DMF中，常温搅拌，加入N- (3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯，加热回流，荧光增白剂CBS-X的酚羟基被叔丁氧酰胺丙氧基所取代；随后将中间产物加入三氟乙酸中，回流搅拌，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的荧光增白剂CBS-X的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合后反应，与载体蛋白偶联制备得到荧光增白剂CBS-X特异性抗原，将荧光增白剂CBS-X特异性抗原包被于酶标板中，所述酶标板的每个微孔内荧光增白剂CBS-X特异性抗原的浓度为1-3 ii g/mL ； 2)制备荧光增白剂CBS-X特异性抗体以步骤I)中合成的荧光增白剂CBS-X特异性抗原作为免疫原对小鼠进行免疫；免疫后，取血清效价高的小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并取不完全佐剂腹腔注射进行致敏后的小鼠，将杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的荧光增白剂CBS-X单克隆抗体；所述荧光增白剂CBS-X特异性抗体的浓度为1-3 u g/mL。
7.根据权利要求6所述的荧光增白剂CBS-X检测试剂盒制备方法，其特征在于，步骤1)中，制备荧光增白剂CBS-X特异性抗原的具体方法为将0.186g的2-磺酸基苯甲醛、0.20g的2-磺酸基-5羟基-苯甲醛和0. 40g的荧光增白剂CBS-X分散于30mL干燥DMSO中，加入哌啶3mL，微波500瓦加热5min，反应结束倒入水中，抽滤固体，得到带有酚羟基的荧光增白剂CBS-X衍生物；将0. 53g的带酚羟基的荧光增白剂CBS-X衍生物和I. Olg的碳酸钾分散于80mL干燥DMF中，常温搅拌30min,加入I. 2g的N-(3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯，加热回流5h，荧光增白剂CBS-X的酚羟基被叔丁氧酰胺丙氧基所取代；随后将中间产物加入30倍的三氟乙酸中，回流搅拌lh，脱去叔丁氧酰基的保护，裸露出胺基，制得能够与蛋白质偶联的荧光增白剂CBS-X的半抗原；再将其与N-羟基丁二酰胺和碳二亚胺混合后反应，与牛血清白蛋白偶联制备得到荧光增白剂CBS-X特异性抗原。
8.根据权利要求6所述的荧光增白剂CBS-X检测试剂盒制备方法，其特征在于，步骤2)为 以步骤I)中合成的荧光增白剂CBS-X特异性抗原作为免疫原对10周龄的Balb/c小鼠进行免疫，首次免疫使用完全弗氏佐剂与荧光增白剂CBS-X特异性抗原溶液乳化，抗原浓度为0. 5mg/mL，剂量为IOOy g/只，以后每次加强免疫使用不完全弗氏佐剂与荧光增白剂CBS-X特异性抗原溶液乳化，剂量同初次免疫；初次免疫两周后，每间隔10天加强免疫一次，共免疫8-10次，当抗体效价不再升高时，进行最后一次免疫；最后一次不加免疫佐剂直接用荧光增白剂CBS-X特异性抗原水溶液直接腹腔注射，剂量同初次免疫；尾部取血检测血清效价；取血清效价高的小鼠，在无菌条件下，取其脾细胞按6:1比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；并Ba lb/C小鼠，于一周前采用不完全佐剂腹腔注射进行致敏，剂量为0. 5mL/只；将细胞浓度为I. 5万/mL的杂交瘤细胞混悬液注射到小鼠腹腔中，剂量为0. 5mL/只；接种杂交瘤细胞6-10天后，收集腹水，反复收集数次；存于4°C冰箱保存；经辛酸-硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，得到纯化的荧光增白剂CBS-X单克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了一种荧光增白剂CBS-X检测试剂盒，属于添加剂检测技术领域。该试剂盒包括每个微孔内包被浓度为1-3μg/mL荧光增白剂CBS-X特异性抗原的酶标板，浓度为1-3μg/mL的荧光增白剂CBS-X特异性抗体，且所述荧光增白剂CBS-X特异性抗原与荧光增白剂CBS-X特异性抗体溶液的用量比为11。本发明还公开了一种荧光增白剂CBS-X检测试剂盒制备方法。本发明的试剂盒在检测荧光增白剂CBS-X时可一次连续检测多个样品，具有便捷，快速，灵敏、成本低的特点。适合用于快速而准确得检测大批量样品中的荧光增白剂CBS-X。
文档编号G01N33/543GK102798712SQ20121028173
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月8日 优先权日2012年8月8日
发明者冼燕萍, 郭新东, 罗海英, 侯向昶, 吴玉銮, 邓龙, 罗东辉, 柯振华 申请人:广州市质量监督检测研究院