专利名称：三线态-三线态湮灭的上转换发光显微镜的制作方法
技术领域：
本实用新型属于光学显微镜技术领域，具体为一种三线态-三线态湮灭的上转换发光显微镜，该显微镜使用普通连续激光器(中心波长在可见区或近红外区)作为激发光源，采用短通分色镜(激发光反射，短波长的发射光透过)收集发射光区的信号。
背景技术：
突光显微镜是生命科学、医学和材料科学研究中的一个重要工具。其中，基于突光材料单光子过程的共聚焦荧光显微镜由于其高分辨率、高灵敏度和高放大率等特点，已经成为细胞形态学、(分子)细胞生物学、神经学、药理学、遗传学等领域中不可缺少的研究工具。但它也有固有的缺陷，如样品容易被光漂白，不能完全消除生物样品自发荧光的干扰，使用紫外光和蓝光等短波长的激光作为激发光造成成像深度有限(几十微米)，同时短波长的光容易损伤生物样品。随后发展起来的双光子荧光显微镜采用波长在红外光区的飞秒激光作为激发光源，减小了激发光对生物样品的光损伤，提高了成像深度(几百微米)，同·时减弱了非焦面的光漂白。由于现有的荧光材料的双光子吸收性能非常有限，双光子显微镜的激发光源必须使用昂贵的飞秒脉冲激光器( $200，000)，因此，基于飞秒激光技术的双光子荧光显微镜难以普及。此外，脉冲的飞秒激光具有极高的瞬时功率(峰值功率密度一般大于(10nW/Cm2)，所以焦点处的漂白不可避免，限制了双光子荧光显微镜在生物样品长时间连续成像中的使用。近年来，稳态激光泵浦的上转换发光材料在生物成像中的应用引起了越来越多研究者的重视。典型的是稀土上转换发光纳米晶材料，和传统的荧光材料相比，这类材料具有特殊的上转换发光性质，即能吸收两个或两个以上低能光子而辐射一个高能光子，通常是将近红外光(主要是980nm)转换成可见光。采用980nm光作为激发光，可以减小激发光对生物样品的损伤，提高成像深度，而使用廉价的稳态激光器( $2，000)大大降低了仪器造价。另外，由于生物样品内源性荧光物质不能被稳态近红外激光激发，使用这类材料可以完全消除生物样品自发荧光的干扰，但是此方法受限于材料本身稀土离子其低的吸收截面(约为10_21)和低量子产率(< 1% )，而且980nm光激发容易导致会导致生物样品的辐照部位出现过热效应。最近，基于三线态-三线态湮灭(TTA)上转换发光材料引起了人们注意。TTA上转换发光的过程是敏化剂受激于一个长波长低能量的激发光光子后从基态跃迁到激发态，立刻通过系间窜越(ISC)到达激发三线态；再通过敏化剂三线态与受体(Acceptor)三线态间的能量传递(TTET)到达受体的激发三线态；随后，两个受激的受体分子间发生三线态-三线态湮灭(TTA)，使一个受体被激发到能量更高的单线态，最终通过辐射跃迁回到基态实现短波长的发射，完成上转换发光过程。该类TTA上转换发光材料具有吸收截面大(约为IO-18)、激发功率密度低(mW/cm_2)、量子产率高(可达到15% )、敏化剂和受体(湮灭剂)可选择空间大以及上转换效率高等突出优点。因此，如果能将三线态-三线态湮灭上转换发光材料与显微技术结合起来，发展一种新型的显微镜，则有望解决共聚焦和双光子荧光显微镜存在的一些问题，为生命科学、医学和材料科学研究提供一种新的方法。发明内容本实用新型的目的在于提供一种三线态-三线态湮灭上转换发光显微镜，该显微镜能直接对三线态-三线态湮灭上转换发光性质的材料进行成像，也可以将三线态-三线态湮灭上转换发光材料孵育细胞进行成像。本实用新型的技术解决方案是一种三线态-三线态湮灭上转换发光显微镜，包括物镜和载物台组成的显微镜光学系统，其特征在于将普通连续波激光器6 (中心波长500-1000nm)产生的稳态激光束通过光纤11导入该显微镜光学系统中，沿该激光束前进方向上依次放置可翻转的激发二向色镜5 (激发光反射，短波长发射光透过)、检流计反射镜4，其中激发二向色镜5与该激光束成45°放置，在垂直于该激光束且穿过该二向色镜的光轴上，同轴地在该二向色镜前方依次放置有共聚焦针孔7、光栅8、狭缝9和光电倍增管检测器10，在检流计反射镜4上方依次放置有物镜3、样品I和载物台2，样品I位于载物台2上。·[0008]本实用新型的工作过程是稳态激光束经过可翻转的激发二向色镜5(激发光反射，短波长发射光透过)、检流计反射镜4，经过物镜3会聚在物镜的焦点上，样品I中具有三线态-三线态湮灭的上转换发光性质的材料在激光的激发下发射沿各方向的上转换发光，一部分上转换发光信号由物镜3收集转换成平行光束，然后重新反射通过检流计反射镜4、可翻转的激发二向色镜5 (激发光反射，短波发射光透过)、共聚焦针孔7、光栅8，再通过狭缝9，一定波长范围的信号被截取，然后被光电倍增管检测器10接收。本实用新型与已有的荧光显微成像技术相比，具有以下优点1.由于生物样品内源性荧光物质和常用的有机荧光染料不会产生三线态-三线态湮灭的上转换发射，因此本实用新型消除了生物样品自发荧光和有机荧光染料发光等背景荧光的干扰，是一种高灵敏度的成像技术。2.由于三线态-三线态湮灭的上转换发光材料几乎不被光漂白，采用较低功率的连续波激光器作为激发光源，几乎不产生热效应，因此本实用新型是一种能对生物样品进行较长时间连续观察的成像技术。3.本实用新型采用较低功率的连续波激光器作为激发光源，和双光子荧光显微镜采用的飞秒激光器相比，价格低廉，因此本实用新型易于推广普及。以下结合附图
及实施例对本实用新型作进一步说明。图I是本实用新型的基本结构示意图图中标识1样品，2可升降载物台，3物镜，4检流计反射镜，5激发二向色镜，6连续波激光器，7共聚焦针孔，8光栅，9狭缝，10光电倍增管检测器，11光纤。图2是用本实用新型的一个实施例获得的三线态-三线态湮灭的上转换发光材料标记的细胞图像。(a)是上转换发光图像，543nm激发，420-480nm发射，(b)405nm光激发的三线态-三线态湮灭的上转换发光材料中的湮灭剂的荧光发射图像，(c)是a、b和明场叠加的图像。图3是用本实用新型的一个实施例获得的三线态-三线态湮灭的上转换发光材料和商用染核试剂Hoechst 33258共同标记的细胞图像。(a)是405nm光激发下的染核试剂和三线态-三线态湮灭的上转换发光材料中的湮灭剂的蓝色荧光发射，(b)是543nm光激发的三线态-三线态湮灭的上转换发光材料的上转换蓝色发射。图4是用本实用新型的一个实施例获得的三线态-三线态湮灭的上转换发光材料和有机荧光染料DPA的光漂白实验结果。
具体实施方式
下面根据图I给出本实用新型的一个较好的实施例，用以说明本实用新型的结构特征和功能特点，而不是用来限定本实用新型的范围。如图I所示，本实施例中，连续波激光器(中心波长为543nm)6、二向色镜5(543nm光被反射，500nm以下光透过)、检流计反射镜4、物镜3、样品台I、光电倍增管10等依次成光路联结。通过光栅8选择一定波长范围的信号有检测器接收。同时计算机与检测器和扫描镜连接，实现图像的采集和扫描控制。本实施例中，激光器中心激发波长为543nm。二向色镜(反射波长大于515nm的光，透过波长小于515nm的光)，显微镜采用OLYMPUS 1X81倒置显微镜，共聚焦扫描单元为OLYMPUS FV1000，检测器是R6357 Enhancedmodel (HAMAMATSU)，图像存储、分析及扫描控制软件为FVlO-ASW(OLYMPUS)。·如图2所示，用本实施例对三线态-三线态湮灭的上转换发光材料标记的细胞进行二维成像，可以获得清晰的图像，其中(a)是上转换发光图像，543nm激发，420-480nm发射，(b)405nm光激发的三线态-三线态湮灭的上转换发光材料中的湮灭剂的荧光发射图像，(c)是a、b和明场叠加的图像。如图3所示，三线态-三线态湮灭的上转换发光材料和商用染核试剂Hoechst33258共同标记的细胞图像，三线态-三线态湮灭的上转换发光显微镜技术可消除普通荧光干扰。在405nm光激发下，染核试剂Hoechst 33258和三线态-三线态湮灭的上转换发光材料中的湮灭剂DPA的荧光发射(420-480nm)都能被激发出来，不能进行有效区分，如图a。在543nm光激发下，三线态-三线态湮灭的上转换发光材料的上转换蓝色发射(420_480nm)被激发出来，同时染核试剂Hoechst 33258在该543nm光激发下在蓝光通道(420_480nm)检测不到其荧光发射，如图b，细胞核区没有荧光信号。对比两组数据可以说明三线态-三线态湮灭的上转换发光显微镜技术可以完全消除来自内源荧光或共同标记的普通荧光物质的干扰。如图4所示，用本实施例通过时间序列扫描成像的方法考察了三线态-三线态湮灭的上转换发光显微成像技术和普通荧光成像技术对材料DPA的光漂白情况。首先考察三线态-三线态湮灭的上转换发光显微成像技术对材料发光的光漂白，在输出功率为O. 57mff的543nm激光辐照600秒，三线态-三线态湮灭的上转换发光材料的上转换发光(430nm)仍然保持99%的强度。而在输出功率为O. 15mff的405nm光辐照600秒后，有机染料DPA的荧光(430nm)发光强度迅速下降到其实荧光强度的I %。对比数据说明三线态-三线态湮灭的上转换发光材料的光稳定性远远高于有机突光染料，三线态-三线态湮灭的上转换发光显微成像技术几乎不造成上转换发光材料光漂白。
权利要求1.一种三线态-三线态湮灭上转换发光显微镜，包括物镜和载物台组成的显微镜光学系统，其特征在于将中心波长500-1000nm普通连续波激光器(6)产生的稳态激光束通过光纤(11)导入该显微镜光学系统中，沿该激光束前进方向上依次放置可翻转的激发二向色镜(5)、检流计反射镜(4)，其中激发二向色镜(5)与该激光束成45°放置，在垂直于该激光束且穿过该二向色镜(5)的光轴上，同轴地在该二向色镜(5)前方依次放置有共聚焦针孔(7)、光栅⑶、狭缝(9)和光电倍增管检测器(10)，在检流计反射镜(4)上方依次放置有物镜(3)、样品(I)和载物台(2)，样品(I)位于载物台(2)上；所述的激发二向色镜为激发光反射，短波长发射光透过。·
专利摘要本实用新型涉及一种三线态-三线态湮灭的上转换发光显微镜，包括物镜和载物台组成的显微镜光学系统，其特征在于将中心波长500-1000nm普通连续波激光器产生的稳态激光束通过光纤导入该显微镜光学系统中，沿该激光束前进方向上依次放置可翻转的激发光反射、短波长发射光透过的激发二向色镜、检流计反射镜，其中激发二向色镜与该激光束成45°放置，在垂直于该激光束且穿过该二向色镜的光轴上，同轴地在该二向色镜前方依次放置有共聚焦针孔、光栅、狭缝和光电倍增管检测器，在检流计反射镜上方依次放置有物镜、样品和载物台。本实用新型能直接对具有三线态-三线态湮灭的上转换发光性质的材料进行成像，也可以将三线态-三线态湮灭的上转换发光材料引入细胞、组织或其它基质中进行成像。
文档编号G01N21/63GK202757884SQ20122011205
公开日2013年2月27日 申请日期2012年3月22日 优先权日2012年3月22日
发明者李富友, 刘倩, 杨天赦 申请人:复旦大学