一种检测罗丹明b的酶联免疫试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测罗丹明B的酶联免疫试剂盒和检测方法，属于食品安全检测【技术领域】。本发明试剂盒配制简单，且能够灵敏、简便、快速、准确地检测样本中的罗丹明B含量。
【专利说明】一种检测罗丹明B的酶联免疫试剂盒及检测方法 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及食品安全检测领域。具体而言，本发明涉及一种用于检测罗丹明B的 酶联免疫检测试剂盒和检测方法。 【背景技术】
[0002] 罗丹明B (Rhodamine B)又称玫瑰红B或碱性玫瑰精，俗称花粉红，是一种鲜桃红 色人工合成染料。经动物实验发现，罗丹明B是致癌物质，因此不允许添加到食品中。2008 年卫生部发布《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单(第一 批)》，明确规定禁止在食品中添加罗丹明B类工业染料。但仍有很多非法企业将罗丹明B 添加于调味品和其他食品中用作染色剂。因此急需建立一种快速灵敏的检测方法，用于检 测食品中非法添加的罗丹明B。
[0003] 目前，罗丹明B的检测主要是实验室仪器分析，如高效液相-荧光检测法和高效液 相-质谱联用检测法，而免疫分析相关产品在市场上较少。但实验室分析用仪器设备及其 运行维护成本较高，对操作人员的专业要求也较高。而免疫分析较于仪器分析，前处理方法 简便、检测快速、可用于现场检测并且便于推广。
[0004] 因此，本领域需要配制简单，且能够灵敏、简便、快速、准确地检测样本中的罗丹明 B含量的酶联免疫试剂盒。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种酶联免疫试剂盒以及检测方法，用于检测食品中添加的 罗丹明B。
[0006] -方面，本发明提供了用于定量检测罗丹明B的酶联免疫试剂盒，所述试剂盒包 括：样品稀释液，其为含有1%至5%海藻糖的pH7. 4的0. 01M磷酸盐缓冲液。
[0007] 在一个实施方式中，所述试剂盒还包括：
[0008] 包被有罗丹明B合成抗原的酶标板，其中罗丹明B合成抗原的包被浓度为0. 5至 1. 5 μ g/mL ；
[0009] 罗丹明B单克隆抗体工作液，其为含0.5至1.0 μ g/mL罗丹明B单克隆抗体的 pH7. 4的0. 01M磷酸盐缓冲液；
[0010] 辣根过氧化物酶标记的IgG抗体工作液，其为含0. 5至1. 0 μ g/mL辣根过氧化物 酶标记的IgG抗体的pH7. 4的0. 01M磷酸盐缓冲液。
[0011] 在一个实施方式中，所述罗丹明B合成抗原配制在pH9. 8的0.02M碳酸盐缓冲液 中。
[0012] 在一个实施方式中，所述试剂盒中，罗丹明B合成抗原的包被浓度为1 μ g/mL。
[0013] 在一个实施方式中，所述试剂盒中，罗丹明B单克隆抗体工作液为含0. 5 μ g/mL罗 丹明B单克隆抗体的pH7. 4的0. 01M磷酸盐缓冲液。
[0014] 在一个实施方式中，所述试剂盒中，辣根过氧化物酶标记的IgG抗体工作液为含 1 μ g/mL辣根过氧化物酶标记的IgG抗体的pH7. 4的0. 01M磷酸盐缓冲液。
[0015] 在一个实施方式中，所述试剂盒中，样品稀释液为含有1%海藻糖的pH7. 4的0.01M 磷酸盐缓冲液。
[0016] 在一个实施方式中，所述试剂盒还包括：
[0017] 罗丹明B标准品；
[0018] 显色液A，其为万分之五至千分之一的过氧化氢或过氧化脲；
[〇〇19] 显色液B，其为万分之三至万分之五的四甲基联苯胺；
[0020] 终止液，其为1. 8至2. Omol/L的硫酸溶液；
[0021] 洗涤液，其为含吐温200. 1%_0· 5%的磷酸盐缓冲液。
[0022] 在一个实施方式中，所述的试剂盒还包括
[0023] 罗丹明B标准品；
[0024] 显色液A，其为万分之五的过氧化氢或过氧化脲；
[0025] 显色液B，其为万分之三的四甲基联苯胺；
[0026] 终止液，其为2mol/L的硫酸溶液；
[0027] 洗涤液，其为含0. 1%_0. 5%吐温20的磷酸盐缓冲液。
[0028] 在本发明中，用于制备酶标板的固相材料包括但不限于聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙 烯，载体的形式是凹孔型微量反应板。
[0029] 在一个实施方式中，所述的试剂盒还包括罗丹明B提取液和使用说明书。
[0030] 在一个实施方式中，所述罗丹明B提取液为甲醇、甲醇水溶液、乙腈或正己烷。
[0031] 另一方面，本发明提供了通过酶联免疫实验检测样品中的罗丹明B的方法，所述 方法包括使用本发明的试剂盒。
[0032] 在一个实施方式中，所述方法包括：
[0033] 用样品稀释液配制罗丹明B标准品或待测样品。
[0034] 在一个实施方式中，所述方法包括：
[0035] 显色步骤中每孔加入等体积显色液A和B。
[0036] 在一个实施方式中，所述方法包括：
[0037] (1)用样品稀释液配制浓度为0、0· 1、0· 3、0· 9、2· 7、和8. lng/ml的罗丹明B标准 品；
[0038] (2)显色步骤中每孔加入等体积显色液A和B。
[0039] 在一个实施方式中，所述的方法还包括提取待测样品中的罗丹明B的步骤。
[0040] 在一个实施方式中，所述的方法中提取待测样品中的罗丹明B的步骤包括：（1)加 入一定体积的提取液，样品质量与提取液体积比为1:5到1:10 ; (2)提取时间为15到30分 钟；（3)离心或静置后，取上清液用氮气吹干；（4)加入样品稀释液复溶，氮气吹干前后溶液 的体积比为1:4到1:5。
[0041] 在一个实施方式中，本发明罗丹明B的检测方法包括：（1)将试剂盒从保存条件下 恢复室温；（2)提取待测样品中的罗丹明B (样品前处理步骤）；（3)配制罗丹明B标准品 工作液；（4)依次在酶标板的孔中加入标准品或样品、酶标记的IgG抗体工作液和抗体工作 液；（5) 25°C孵育；（6)洗涤；（7)在酶标板的孔中加入显色液；（8) 25°C显色；（9)加入终 止液；（10)在酶标仪上于450nm处读数；（11)根据标准曲线公式计算出样品中罗丹明B的 含量。
[0042] 在一个实施方式中，样品前处理方法包括：（1)称取一定质量的样品；（2)加入一 定体积的提取液(包括但不限于，例如甲醇、甲醇水溶液、乙腈、正己烷)，样品质量与提取 液体积比为1:5到1:10 ; (3)提取时间为15到30分钟；（4)离心或静置后，取上清液用氮 气吹干；（5)加入样品稀释液复溶，氮气吹干前后溶液的体积比为1:4到1:5 ; (6)取50 μ L 复溶后的溶液检测。
[0043] 本发明试剂盒的检测原理为：
[0044] 将罗丹明Β合成抗原包被在固相载体上；加入罗丹明Β标准品或样品，并加入酶标 记的IgG抗体与罗丹明Β抗体，样品中的罗丹明Β与酶标板上固定的罗丹明Β竞争结合试 剂中的抗体，并且酶标记的IgG抗体与罗丹明B抗体反应；通过洗涤除去没有结合的罗丹明 B抗体与酶标记的IgG抗体；通过酶催化显色剂显色，显色后终止，测定样品的吸光度值；样 品的吸光度值与罗丹明B的浓度呈负相关，与标准曲线比较计算可得出样品中罗丹明B的 浓度。
[0045] 有益效果：
[0046] 本发明检测罗丹明B的试剂盒主要采取间接竞争酶联免疫测定法，定性或定量检 测样品中罗丹明B的含量；检测过程采用一步孵育法，进一步缩短了检测时间，与通常的两 步孵育间接竞争法相比，检测时间由1小时15分钟缩短为45分钟。本检测方法提供的样 品前处理方法适用于多种食品，前处理过程较简单，能同时检测大批样品。
[0047] 本发明试剂盒使用罗丹明B单克隆抗体，主要试剂以工作液形式提供，为使用者 简化操作步骤，节省操作时间。本发明试剂盒的优点在于灵敏度高、特异性强、准确度高、对 样品需求量少、对仪器设备要求低、试剂保存时间长等，可以在调味料等食品安全检测中发 挥重要作用，有重大的社会意义和广阔的市场前景。 【专利附图】
【附图说明】
[0048] 图1为通过本发明试剂盒获得的罗丹明B标准曲线。
[0049] 图2为通过江大绿康试剂盒获得的罗丹明B标准曲线。
[0050] 图3为样品稀释液中不含海藻糖时的标准曲线。 【具体实施方式】
[0051] 提供下述实施例是为了更好的进一步理解本发明，而却不对本发明的内容和保 护范围构成任何限制。
[0052] 实施例中所用主要试剂来源和组成
[0053] 罗丹明B合成抗原与罗丹明B鼠源单克隆抗体购于广州优抗多生物有限公司；辣 根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG抗体购于武汉艾美捷科技有限公司；罗丹明B标准品 购于北京北纳创联生物技术研究院。
[0054] 样品稀释液：0. 01M磷酸盐缓冲液，pH7. 4,含有1%的海藻糖
[0055] 碳酸盐缓冲液：0· 02M碳酸盐缓冲液，ρΗ9· 8
[0056] 洗涤液：0· 01Μ磷酸盐缓冲液，ρΗ7· 4,含(λ 1%-0· 5%吐温20
[0057] 封闭液：0· 01Μ磷酸盐缓冲液，ρΗ7· 4,含有1%的BSA
[0058] 磷酸缓冲液：0. 01M磷酸盐缓冲液，pH7. 4
[0059] 显色液A :浓度为万分之五的过氧化氢或过氧化脲溶液
[0060] 显色液B :浓度为万分之三的四甲基联苯胺溶液 [〇〇61] 终止液：2mol/L的硫酸溶液
[0062] 实施例1 :间接竞争ELISA方法的建立
[0063] 1. 1ELISA方阵确定最佳反应浓度
[0064] 1. 1. 1实验方法
[0065] (1)包被：罗丹明B合成抗原（10mg/mL)，用碳酸盐缓冲液稀释5000、10000或 20000倍包被，包被量为每孔100 μ L，4°C过夜；用洗涤液(含0. 25%吐温20)洗涤三次，每次 300 μ L/孔，拍干。（2)封闭：每孔加入200 μ L封闭液，37°C温育3小时；用洗涤液洗涤三次， 每次300 μ L/孔，拍干。（3)每孔依次加入0· 01M磷酸盐缓冲液（ρΗ7· 4)，用0· 01M磷酸盐 缓冲液（ΡΗ7. 4)稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG抗体(稀释1000或2000倍） 和用0. 01M磷酸盐缓冲液（pH7. 4)稀释的罗丹明B单克隆抗体(稀释5000、10000或20000 倍)，各50 μ L ; (4)孵育：室温孵育30min ;之后，用洗涤液洗涤五次。（5)显色：每孔加入 显色液A与显色液B各50 μ L，室温避光作用15min。（6)每孔加入50 μ L终止液，用酶标 仪（Thermo酶标仪，型号：ΜΚ3)检测其450nm处的0D值。（7)同时设置两个平行。取0D值 2.0左右时的包被浓度、罗丹明B单克隆抗体浓度和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体浓度为最佳浓度。
[0066] 1. 1. 2实验结果：
[0067] 表1 :方阵法0D值
[0068]
【权利要求】
1. 用于定量检测罗丹明B的酶联免疫试剂盒，所述试剂盒包括： 样品稀释液，其为含有1%至5%海藻糖的pH7. 4的0. 01M磷酸盐缓冲液。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其还包括： 包被有罗丹明B合成抗原的酶标板，其中罗丹明B合成抗原的包被浓度为0.5至 1. 5 μ g/mL ； 罗丹明B单克隆抗体工作液，其为含为0. 5至1. 0 μ g/mL罗丹明B单克隆抗体的pH7. 4 的0. 01M磷酸盐缓冲液； 辣根过氧化物酶标记的IgG抗体工作液，其为含0. 5至1. 0 μ g/mL辣根过氧化物酶标 记的IgG抗体的pH7. 4的0. 01M磷酸盐缓冲液。
3. 如权利要求1或2所述的试剂盒，其还包括 罗丹明B标准品； 显色液A，其为万分之五至千分之一的过氧化氢或过氧化脲； 显色液B，其为万分之三至万分之五的四甲基联苯胺； 终止液，其为1. 8至2. Omol/L的硫酸溶液； 洗涤液，其为含〇. 1%-〇. 5%吐温20的磷酸盐缓冲液。
4. 如前述任一项权利要求所述的试剂盒，其中用于制备所述酶标板的固相材料为聚苯 乙烯、聚乙烯或聚丙烯，载体的形式是凹孔型微量反应板。
5. 如前述任一项权利要求所述的试剂盒，其还包括罗丹明B提取液和使用说明书。
6. 如权利要求5所述的试剂盒，其中所述罗丹明B提取液为甲醇、甲醇水溶液、乙腈或 正己烷。
7. 通过酶联免疫实验检测样品中的罗丹明B的方法，所述方法包括使用权利要求1-6 中任一项所述的试剂盒。
8. 如权利要求7所述的方法，其包括 用样品稀释液配制罗丹明B标准品或待测样品。
9. 如权利要求7或8所述的方法，其还包括 显色步骤中每孔加入等体积显色液A和B。
10. 如权利要求7-9任一项所述的方法，其还包括提取待测样品中的罗丹明B的步骤。
【文档编号】G01N33/577GK104101709SQ201310126445
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月12日 优先权日:2013年4月12日
【发明者】王琳, 王雪, 张俊萍, 田静秒, 郑清林 申请人:北京普析通用仪器有限责任公司