一种高通量过敏原特异性抗体IgE检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种高通量过敏原特异性抗体IgE检测试剂盒及检测方法，该试剂盒主要包括：固化有待测过敏原蛋白的纤维材料膜，生物素偶联的抗人IgE抗体，多聚酶标记的链霉亲和素，以及与多聚酶对应的显色剂；所述人IgE抗体为羊抗人IgE抗体或兔抗人IgE抗体，所述多聚酶为多聚碱性磷酸酶或多聚辣根过氧化物酶。本发明试剂盒可定性或半定量地快速检测人血清或血浆中的过敏原特异性抗体IgE浓度，并可一次筛查数十种过敏原，快速、准确、样品用量少，适宜进行高通量检测。
【专利说明】-种高通量过敏原特异性抗体IgE检测试剂盒及检测方法 (-)【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高灵敏地定性或半定量地筛査或检测人血清或血浆中的多个过 敏原特异性I班抗体水平的检测试剂盒及检测方法。 (二）【背景技术】
[0002] 2011?2012年世界变态反应组织（WAO)关于变态反应(也称过敏反应，Allergy) 的白皮书指出："过敏性疾病的流行在发达国家和发展中国家全世界范围内正戏剧性地上 升。过敏性疾病包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、严重过敏反应，药物、食物及昆虫过敏反应， 湿疹、専麻疹(枯草热）和血管性水肿。过去二十年尤其是儿童患过敏性疾病人数的增加有 暴发的趋势。"（Pawankar R et al, WAO White Book on Allergy 2011-2012:Executive Summary.)仅食物引发的过敏性疾病的流行率就达3%?6%。（Sicherer S H, !Epidemiology of food allergy. J Allergy Clin Immunol. 2011;127:594-602.)过敏性疾病是患者吸 入或摄食入含有致敏成分的物质(称为过敏原或变应原，Allergen)后触发机体的B细胞 产生过量的免疫球蛋白E (Immunoglobulin E，I班），当I班抗体在体内再次接触过敏原 时就与过敏原交联结合到服大细胞和嗜碱性粒细胞表面上的高亲和受体化￡ Rl上，导致 化￡ Rl受体的聚集，使服大细胞和嗜碱性粒细胞活化。服大细胞在活化过程中脱颗粒并释 放储存在细胞浆颗粒里的炎性介质：组胺，与通过花生四帰酸途径合成的白H帰、免疫反应 性前列腺素和IL4、IL5等细胞因子及趋化因子，引发过敏反应的疾病症状。过敏性疾病的 发生，I班抗体起关键作用，称为I班介导的过敏反应。I班介导的过敏性疾病的特征是患 者体内循环血液中的过敏原特异性I班（SlgE)抗体浓度较正常状况下高，且病症越严重， si班抗体浓度越高。（Bloebaum R M et al, 2004, Mechanisms of I班-mediated allergic reactions, IniLockey RF et al ed,Allergens and allergen immunotherapy， Marcel Dekker，Inc, New York, USA, PP65-84.)
[0003] 过敏性疾病的临床诊断在美国临床医师实用指南中指出，根据患者病史结 合点刺或血液检测过敏原特异性I班（Si班）抗体浓度，筛查致病过敏原（Siles R I,Hsieh F H, Allergy blood testing:A practical guide for clinicians. Am Clin J Medicine. 2011;78:585-592.)。目前，检测血液中过敏原特异性I浊（si浊）抗体浓度， 筛查致病过敏原的方法有酶免疫法（EIA)、免疫印迹法（Immunoblotting Assay)、胶体金 侧流层析法化FA)、蛋白芯片法（Proteins microarray)等，发展趋势并符合市场要求的 是：自动化、快速、准确、样品用量少，一次筛查几十种过敏原。市场上产品不少，其中，瑞典 Pharmacia公司产品ImmunoCAP 250系统是酶免疫法的代表，ImmunoCAP Rapid是胶体金 侧流层析法的代表，ImmunoCAP ISAC是蛋白芯片法的代表，开创了过敏原分子诊断；而德 国Mediwiss-anal}ftic公司的AllergyScreen则是免疫印迹法的代表（AlleisaScreen⑩ Immunoblot for analysing specific IgE in human serum)。为满足自动化、快速、准石角、 样品用量少，一次筛查几十种过敏原，半定量或定量检测样品中的过敏原特异性I班(si班） 抗体浓度的要求，它们均配置了检测仪。瑞典Pharmacia公司产品ImmunoCAP Rapid -次 只能筛查十来种过敏原，不配阅读仪，肉眼判读Si班抗体浓度的灵敏度只有I. OlU/ml，用 1. 49IU/ml区分阴性和阳性结果。 (H)
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供一种高通量过敏原特异性抗体I班检测试剂盒(免疫印迹法)， 用W定性或半定量地快速检测人血清或血浆中的过敏原特异性抗体I班浓度，并可一次筛 查数十种过敏原。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] 一种高通量过敏原特异性抗体I班检测试剂盒，主要包括；固化有待测过敏原 蛋白的纤维材料膜，生物素偶联的抗人I班抗体(使用时可用抑7. 4的PBS配制成浓度 1:100?10000的工作液)，多聚酶标记的链霉亲和素(使用时可用抑7. 4的PBS配制成浓度 1:5000?50000的工作液)，W及与多聚酶对应的显色剂(可市购获得，也可W抑7. 4的PBS 为溶剂自行配制）；所述人I班抗体为羊抗人I班抗体或兔抗人I班抗体，所述多聚酶为多 聚碱性磯酸酶或多聚辣根过氧化物酶。上述为试剂盒的主要成分，不包含检测所用的常规 试剂如稀释液、洗涂液等。
[0007] 所述纤维材料膜为硝酸纤维素膜，混合纤维素醋膜或者多孔PVF膜等，具有足夠 抗弯曲和抗折皱机械强度，固化待测过敏原蛋白后固置于反应槽内。纤维材料膜随需固化 的过敏原蛋白不同，可分别采用漠化膳、戊二酵、駿基变性、氨基变性、氯甲基变性等方法活 化纤维材料膜，使之能共价结合足量（0. 2?2. Oug)的相应的过敏原蛋白，W便能充分结合 样品液中的Si班抗体，确保检测结果的准确性。所述过敏原蛋白可按常规方法从下列天然 原材料中提取，包括：植物花粉类(树花粉类、草花粉类及野草花粉类等）过敏原；霉菌类过 敏原；动物皮屑类过敏原；昆虫类过敏原；植物食物类(包括水果类、蔬菜类、坚果类、食用 菌类及谷物类）过敏原和动物食物类(包括肉类、禽蛋类、魚和甲壳类及奶类）过敏原等。
[0008] 本发明试剂盒同时使用生物素偶联的抗人I班抗体捕获剂溶液和多聚酶标记的 链霉亲和素溶液，既具生物素-链霉亲和素的生物放大系统，又具多聚酶-显色放大作用， 极大提高检测灵敏度。
[0009] 优选的，所述多聚酶为多聚碱性磯酸酶，对应的显色剂为硝基四氮哇兰和 5-漠-4-氯-3-日引巧磯酸的混合物（NBT/BCIP，Nit;roblueTetrazolium/5-B;romo-4-chlor o-3-Indolyl Phosphate),或对石肖基苯胺（p-nitrophenyl phosphate)。
[0010] 或者，所述多聚酶为多聚辣根过氧化物酶，对应的显色剂为3, 3'，5, 5'-四甲基 联苯胺（TMB, Tetramethy化enzidine),邻苯二胺（O-Phenylenediamine),联苯二胺（DAB, 3,3' -diaminobenzidine tetrahydrochloride),或者过氧化尿素。
[0011] 本发明还涉及一种利用所述试剂盒高通量检测过敏原特异性抗体I班的方法，所 述包括：
[0012] (1)取内壁贴有固化有待测过敏原蛋白的纤维材料膜的反应槽，室温下水平放置， 备用；
[0013] (2)将200?400微升血清或血浆加入反应槽的加液孔内，再加入样品稀释液，3? 6分钟后将反应槽置于混匀器上，室温赔育30?60分钟；所述样品稀释液为常规含有新生 牛血清的缓冲液；
[0014] (3)用洗涂液冲洗液反应槽，重复清洗3?5次，每次10?30砂；所述洗涂液为 常规含有表面活性剂(如吐温-20)的洗涂液；
[0015] (4)加200?400微升生物素偶联的抗人I班抗体工作液入反应槽内，置于混匀器 上室温赔育30?60分钟；
[001引（5)用洗涂液冲洗液反应槽，重复清洗3?5次，每次10?30砂；
[0017] (6)在反应槽内加入200?400微升多聚酶标记链霉亲和素的工作液，置于混匀器 上室温赔育15?30分钟；
[001引（7)用洗涂液冲洗液反应槽，重复清洗3?5次，每次10?30砂；
[0019] (8)在反应槽内加入200?400微升显色剂溶液，置于混匀器上室温赔育10?30 分钟；
[0020] ( 9 )流水冲洗终止酶反应；
[0021] (10)将反应槽与比色卡比对判读，或者用阅读仪进行判读。
[0022] 所述比色卡可依据国际通用的血清中特异性抗体I班浓度0?6级分级方法制 作，形式可W是长条形、正方形、H角形及圆形等。颜色随显色剂不同，可W是黄色、兰色和 黑色等，但色彩的强度必须按国际通用的血清中特异性抗体I班浓度0?6级要求一致。
[0023] 按照本发明方法，采用比色卡或不用带数据处理功能的阅读仪，根据操作步骤操 作，就可方便地用肉眼定性或半定量地判读检测人血清或血浆中的多个过敏原特异性I班 抗体水平；使用带数据处理功能的阅读仪，可定量地检测人血清或血浆中的多个过敏原特 异性I班抗体浓度。
[0024] 本发明的有益效果主要体现在；本发明试剂盒可定性或半定量地快速检测人血清 或血浆中的过敏原特异性抗体I班浓度，并可一次筛查数十种过敏原，快速、准确、样品用 量少，适宜进行高通量检测。 (四）
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1为实施例1所用反应槽结构示意图；
[0026] 图2为依据国际通用的血清中特异性抗体I班浓度0?6级分级方法制作的比色 卡（TMB显色）图例。 (五）
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0028] 实施例1 :
[0029] (1)预处理：取出实验所需检测反应槽(结构参见图1，内壁已贴有固化有待测过 敏原蛋白的纤维材料膜)，室温下水平放置，编号或标记患者姓名；
[0030] (2)初次赔育：将300微升血清加入加液孔内，再加入样品稀释液（pH7. 4的 PBS+10%新生牛血清)，5分钟后将反应槽置于混匀器上，室温（20?25C )赔育45分钟。
[0031] (3)清洗；用洗涂液（pH7. 4的PBS+0. 05%吐温-20)冲洗液反应槽，重复清洗5次， 每次10砂钟；冲洗时，使洗涂液充分流过反应槽。注意倾倒洗涂液时让液体顺着反应槽流 下，避免交叉污染。
[0032] (4)第二次赔育；加6滴(约300微升)生物素偶联的兔抗人I班抗体工作液(溶剂 为抑7. 4的PBS，浓度1:10000)入反应槽内，置于混匀器上室温（20?25C )赔育45分钟。
[0033] (5)清洗；过程同步骤（3)。
[0034] (6)第H次赔育：在反应槽内加入6滴多聚辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素的 工作液(溶剂为抑7. 4的PBS，1:50000)，置于混匀器上室温（20?25°C)赔育20分钟。
[00巧](7)清洗；过程同步骤（3)。
[0036] (8)第四次赔育；在反应槽内加入6滴TMB显色溶液（sigma公司），置于混匀器上 室温（20?25 to赔育20分钟。
[0037] (9)终止反应：流水冲洗终止酶反应。
[0038] (10)读数；将反应槽与比色卡（TMB显色的比色卡参见图2)比对判读。
[0039] 按照上述方法，可方便地用肉眼定性或半定量地判读检测人血清中的多个过敏原 特异性I班抗体水平。
【权利要求】
1. 一种高通量过敏原特异性抗体IgE检测试剂盒，主要包括：固化有待测过敏原蛋白 的纤维材料膜，生物素偶联的抗人IgE抗体，多聚酶标记的链霉亲和素，以及与多聚酶对应 的显色剂；所述人IgE抗体为羊抗人IgE抗体或兔抗人IgE抗体，所述多聚酶为多聚碱性磷 酸酶或多聚辣根过氧化物酶。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述多聚酶为多聚碱性磷酸酶，对应的显 色剂为硝基四氮唑兰和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸的混合物，或对硝基苯胺。
3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述多聚酶为多聚辣根过氧化物酶，对应 的显色剂为3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺，邻苯二胺，联苯二胺，或者过氧化尿素。
4. 利用权利要求1所述试剂盒高通量检测过敏原特异性抗体IgE的方法，所述包括： (1) 取内壁贴有固化有待测过敏原蛋白的纤维材料膜的反应槽，室温下水平放置，备 用； (2) 将200?400微升血清或血浆加入反应槽的加液孔内，再加入样品稀释液，3?6 分钟后将反应槽置于混匀器上，室温孵育30?60分钟； (3) 用洗涤液冲洗液反应槽，重复清洗3?5次，每次10?30秒； (4) 加200?400微升生物素偶联的抗人IgE抗体工作液入反应槽内，置于混匀器上室 温孵育30?60分钟； (5) 用洗涤液冲洗液反应槽，重复清洗3?5次，每次10?30秒； (6) 在反应槽内加入200?400微升多聚酶标记链霉亲和素的工作液，置于混匀器上室 温孵育15?30分钟； (7) 用洗涤液冲洗液反应槽，重复清洗3?5次，每次10?30秒； (8) 在反应槽内加入200?400微升显色剂溶液，置于混匀器上室温孵育10?30分 钟； (9) 流水冲洗终止酶反应； (10) 将反应槽与比色卡比对判读，或者用阅读仪进行判读。
【文档编号】G01N33/548GK104237523SQ201310238139
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月14日 优先权日:2013年6月14日
【发明者】吴善东 申请人:杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司