单头烟蚜cmv、pvy带毒检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种单头烟蚜CMV、PVY带毒检测方法，本发明主要采用试剂及材料有CMV、PVY一抗，对应酶标二抗，样品稀释液，洗涤液，显色液，本发明的检测板为烟蚜所携带CMV、PVY病毒蛋白抗原包被的硝酸纤维素膜（NCM），酶结合物工作液为CMV、PVY一抗（羊抗兔）及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体。本发明将单头烟蚜通过一系列处理，利用抗原抗体反应基本原理，便可即时检测烟蚜带毒与否。本发明有益的积极效果是：特异性强、灵敏度高、操作简单、检测成本低，适合于田间大规模推广应用，具有广阔的应用前景。
【专利说明】单头烟蚜CMV、PVY带毒检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其是一种单头烟蚜CMV、PVY带毒检测方法。
【背景技术】
[0002]烟姆(妙沿/5.persicae (Sulzer))是烟草的重要害虫,在我国大部分烟区都有其为害，也是贵州烟区的主要虫害。烟蚜不但刺吸危害烟草，还传播黄瓜花叶病毒(CMV)和马铃薯Y病毒(PVY)，为害症状表现为花叶、矮化和褪绿等，发病流行速度极快，烟草生长发育停滞，严重减产，对烟草产业造成巨大的经济损失。
[0003]黄瓜花叶病毒病(Cucumber mosaic virus, CMV),雀麦花叶病毒科CSroffiOFirit/ae)黄瓜花叶病毒属(Ci/cawoFirw1S)典型成员，于1961年被Doolittle首次发现，是寄主范围最多、分布最广、最具经济重要性的植物病毒之一；马铃薯Y病毒病(Potatovirus Y, PVY)马铃薯 Y 病毒(/biaio virus Y, PVY),马铃薯 Y 病毒科马铃薯Y病毒属)(李凡等，2001)的典型成员。最早由K.M.Smith于1931年在马铃薯上首次发现。是危害烟草生产最重要的两种世界性病害，在中国、日本和德国等地均有报道。为害症状表现为花叶、皱缩、褪緑、斑驳和坏死等，发病流行速度极快，生长发育停滞，严重减产，对烟草的质量造成严重的损失。
[0004]烟姆传播CMV、PVY属于非持久性传播,病毒存在于烟姆体内时间短、病毒量少，因此，其检测方法在田间应用中具有重要影响。目前，国内外对于烟蚜携带CMV、PVY检测方法建立的研究较少，病毒检测所用酶联免疫吸附试验等血清学检测方法，具有一定局限性，不能有效进行检测，很难大面积应用推广。国内外所建立的CMV、PVY的PCR诊断方法由于检测成本过高，在农业生产上无法大规模应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是:提供一种单头烟蚜CMV、PVY带毒检测方法，它可即时检测烟蚜带毒与否，并且特异性强、灵敏度高、操作简单、检测成本低，以克服现有技术的不足。
[0006]本发明是这样实现的:单头烟蚜CMV、PVY带毒检测方法，将单头虫体进行充分研磨、离心，取上清液在硝酸纤维素膜上进行点样包被抗原，再经封闭、抗体反应和染色进行抗原检测。
[0007]取上清液在硝酸纤维素膜上进行点样包被抗原，再经封闭、抗体反应和染色进行抗原检测的具体步骤如下:
I)取上清液加样于硝酸纤维素膜，室温晾干，重复点样3次。
[0008]2)将点样的硝酸纤维素膜浸入质量百分比为5%的脱脂奶粉封闭缓冲液中，在37°C 下封闭 60min ；
3)将封闭后的硝酸纤维素膜用洗涤液洗涤3次，每次3min;加入待检测病毒多抗抗体溶液，抗体与PBS缓冲液按1:200的体积比混合，在37°C下孵育1.5h ；
4)将经过抗体反应的硝酸纤维素膜用洗涤液洗涤3次，每次3min;将硝酸纤维素膜浸入辣根过氧化物酶标记的二抗的抗体溶液，抗体与PBS缓冲液按1:2500的体积比混合，在37°C下孵育1.5h ；
5)将经二抗反应的硝酸纤维素膜用洗涤液洗涤3次，每次3min ;将硝酸纤维素膜浸入显色溶液，在37°C下颜色反应30min，自来水冲洗膜，晾干拍照保存；
所有操作均在震荡条件下进行。
[0009]所述的缓冲液中按质量百分比计算，包含KH2PO4 0.02%, Na2HPO4.12H20 0.29%，NaCl 0.8%, KCl 0.02%，其余为 ddH20, pH 为 7.4。
[0010]所述的洗涤液中按质量百分比计算，包含KH2PO4 0.02%, Na2HPO4.12H20 0.29%，NaCl 0.8%, KCl 0.02%其余为ddH20，每IOOOml上述混合液中加入加入质量百分比为0.05%的 Tween-20 0.5mL，pH 为 7.4。
[0011]所述的显色液为4-氯-1-萘酚6mg，无水乙醇2mL，PBS 10mL，加质量百分比为30% 的 H2O2 7 μ L。
[0012]所述的酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体。
[0013]由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明将单头烟蚜通过一系列处理，利用抗原抗体反应基本原理，便可即时检测烟蚜带毒与否，本发明特异性强、灵敏度高、操作简单、检测成本低，适合于田间大规模推广应用，具有广阔的应用前景。。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1单头烟蚜CMV带毒检测；
CK，对照；显色带病毒样品；无病毒样品；
图2单头烟蚜PVY带毒检测；
CK，对照；显色带病毒样品；无病毒样品。
【具体实施方式】
[0015]本发明的实施例:单头烟蚜CMV、PVY带毒检测方法，
1)将单头虫体放入加入50μ I碳酸盐缓冲液的0.2mL PCR管，用牙签捣碎，8000r/min离心3min ；
2)取上清液3μ I加样于硝酸纤维素膜，室温晾干，重复点样3次，
3)将点样的硝酸纤维素膜浸入质量百分比为5%的脱脂奶粉封闭缓冲液中，在37°C下封闭60min ；
4)将封闭后的硝酸纤维素膜用洗涤液洗涤3次，每次3min;加入待检测病毒多抗抗体溶液，抗体与PBS缓冲液按1:200的体积比混合，在37°C下孵育1.5h ；
5)将经抗体反应的硝酸纤维素膜用洗涤液洗涤3次，每次3min;将硝酸纤维素膜浸入辣根过氧化物酶标记的二抗抗体溶液，抗体与PBS缓冲液按1:2500的体积比混合，在37°C下孵育1.5h ；
6)将经二抗反应的硝酸纤维素膜用洗涤液洗涤3次，每次3min;将硝酸纤维素膜浸入显色溶液，在37°C下颜色反应30min，自来水冲洗膜，晾干拍照保存；
所有操作均在震荡条件下进行。
[0016]所述的缓冲液中按质量百分比计算，包含KH2PO4 0.02%, Na2HPO4.12H20 0.29%，NaCl 0.8%, KCl 0.02%，其余为 ddH20, pH 为 7.4。
[0017]所述的洗涤液中按质量百分比计算，包含KH2PO4 0.02%, Na2HPO4.12H20 0.29%，NaCl 0.8%, KCl 0.02%其余为ddH20，每IOOOml上述混合液中加入加入质量百分比为0.05%的 Tween-20 0.5mL，pH 为 7.4。
[0018]所述的显色液为4-氯-1-萘酚6mg，无水乙醇2mL，PBS 10mL，加质量百分比为30% 的 H2O2 7 μ L。
[0019]所述的酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体。
[0020]利用本发明进行单头烟蚜CMV带毒检测的结构如图1所示；利用本发明进行单头烟蚜PVY带毒检测的结构如图2所示。
[0021]结果表明，本发明可快速、准确的检测出烟蚜带毒与否。
【权利要求】
1.一种单头烟蚜CMV、PVY带毒检测方法，其特征在于:将单头虫体进行充分研磨、离心，取上清液在硝酸纤维素膜上进行点样包被抗原，再经封闭、抗体反应和染色进行抗原检测。
2.根据权利要求1所述的单头烟蚜CMV、PVY带毒检测方法，其特征在于:取上清液在硝酸纤维素膜上进行点样包被抗原，再经封闭、抗体反应和染色进行抗原检测的具体步骤如下: 1)取上清液加样于硝酸纤维素膜，室温晾干，重复点样3次； 2)将点样的硝酸纤维素膜浸入质量百分比为5%的脱脂奶粉封闭缓冲液中，在37°C下封闭60min ； 3)将封闭后的硝酸纤维素膜用洗涤液洗涤3次，每次3min;加入待检测病毒多抗抗体溶液，抗体与PBS缓冲液按1:200的体积比混合，在37°C下孵育1.5h ； 4)将经过抗体反应的硝酸纤维素膜用洗涤液洗涤3次，每次3min;将硝酸纤维素膜浸入辣根过氧化物酶标记的二抗的抗体溶液，抗体与PBS缓冲液按1:2500的体积比混合，在37°C下孵育1.5h ； 5)将经二抗反应的硝酸纤维素膜用洗涤液洗涤3次，每次3min;将硝酸纤维素膜浸入显色溶液，在37°C下颜色反应30min，自来水冲洗膜，晾干拍照保存； 所有操作均在震荡条件下进行。
3.根据权利要求2所述的单头烟蚜CMV、PVY带毒检测方法，其特征在于:所述的缓冲液中按质量百分比计算，包含 KH2PO4 0.02%, Na2HPO4.Iffi2O 0.29%, NaCl 0.8%, KCl 0.02%,其余为ddH20，pH为7.4。
4.根据权利要求2所述的单头烟蚜CMV、PVY带毒检测方法，其特征在于:所述的洗涤液中按质量百分比计算，包含 KH2PO4 0.02%, Na2HPO4.Iffi2O 0.29%, NaCl 0.8%, KCl 0.02%其余为ddH20，每IOOOml上述混合液中加入加入质量百分比为0.05%的Tween-20 0.5mL，pH 为 7.4。
5.根据权利要求2所述的单头烟蚜CMV、PVY带毒检测方法，其特征在于:所述的显色液为4-氯-1-萘酚6mg，无水乙醇2mL，PBS 10mL，加质量百分比为30%的H2O2 7 μ L。
6.根据权利要求2所述的单头烟蚜CMV、PVY带毒检测方法，其特征在于:所述的酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体。
【文档编号】G01N33/543GK103645309SQ201310684361
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】张福莉, 刘磊磊, 刘童童 申请人:贵州大学