一种解脲支原体抗原金标快速检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型属免疫检测领域，具体公开了一种解脲支原体抗原金标快速检测试剂盒，其特征在于所提供检测试剂盒由检测条和塑料卡盒组成。检测条是在衬板上将样品垫a、胶体金垫、样品垫b、硝酸纤维素膜、吸样垫进行有序组合；硝酸纤维素膜上设置包被解脲支原体MB蛋白单克隆抗体a的检测线和羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG抗体的质控线；胶体金垫上固化胶体金标记的解脲支原体MB蛋白单克隆抗体b；检测条安装于塑料卡盒内。本实用新型提供的试剂盒应用“双抗体夹心”免疫技术原理，具有灵敏度高、特异性强、操作简便、快速、无需专门仪器设备的优点，适用于临床对解脲支原体感染的快速检测。
【专利说明】一种解脲支原体抗原金标快速检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及医学临床免疫检测领域，特别是涉及一种解脲支原体抗原金标快速检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]解脲支原体(Ureaplasma urealyticum,UU)是一类介于细菌与病毒之间的最小原核微生物，属支原体的一种，因生长需要尿素而得名。菌体微小，直径仅有15?25um，属于柔膜纲脲原体目脲原体科的脲原体属，主要分布于人体泌尿生殖道，是除沙眼衣原体外最常见的非淋病性尿道炎的病原菌。解脲支原体，除引起非淋菌性尿道炎、宫颈炎、输卵管炎，导致不孕不育，还可通过母婴垂直传播(宫内和产道)，引起宫内感染而导致流产、死胎、早产、新生儿呼吸道感染、脑膜炎等不良后果。国内外资料显示，不孕症夫妇的宫颈粘液、精液中解脲支原体培养阳性率高达50%以上；从流产的组织中检查出解脲支原体的阳性率高达40%以上；解脲支原体占非淋球菌阴道炎的67.6% ;在宫颈炎和阴道炎病例中，解脲支原体检出率为67%。近年来，泌尿生殖道支原体感染在性传播疾病(STD)中发病率呈明显上升趋势，特别是在非淋球菌性尿道炎患者中解脲支原体的检出率占首位。因此，解脲支原体的检测在泌尿生殖系统疾病的诊断上具有重要意义。
[0003]目前临床诊断工作中，检测解脲支原体的主要方法有培养法、PCR法、免疫学方法等。培养法是传统的“金标准”方法，特异性高，但敏感性低、培养耗时长，易污染等因素影响，尤其新生儿病情变化迅速标本不便采集，因此难以接受；PCR法凭借着敏感，特异等优点逐渐显示出了其临床诊断的优越性，但需要特殊的仪器和专门的人员操作，不利于基层医院的推广使用；免疫学方法包括ELISA法、单克隆或多克隆免疫荧光法(IFA)、胶体金法等，其快速、简便、灵敏度高、易于标准化和商品化等优势，使其在临床快速检测上具有很好的发展前景并易于开发成商品化试剂盒。
[0004]胶体金快速诊断技术是在20世纪90年代以来在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新型层析材料基础上发展起来的一项新型体外诊断技术，近年来发展迅速，在生物领域尤其是医学检验中得到了广泛应用。该技术基于以下原理:利用胶体金标记一种抗原或抗体，在硝酸纤维素膜检测层上包被相应配对的特异性抗原或抗体，当待测样品中含有相对应的特异性抗体或抗原时，通过毛细作用向前移动，与胶体金标记物相结合形成待测物胶体金标记复合物，在移动至特异性抗原或抗体包被区时，待测物胶体金标记复合物与之发生特异性结合而被截留，形成肉眼可观察的色带。通过检测线的有无实现对结果的判定。该技术具有操作简便、反应迅速、敏感性高、特异性强、适用于任何场地、经济适用等优点。
[0005]目前国内外均未见到应用胶体金快速诊断技术检测解脲支原体抗原的检测卡。
【发明内容】
[0006]本实用新型是为了提供一种解脲支原体抗原的金标快速检测试剂盒，用于临床快速检测、流行病学调查等。所述检测试剂盒应用“双抗体夹心”的免疫原理，具有灵敏度高、特异性强、检测迅速，操作简便、无需专门设施等特点，为临床提供一种快速简洁的诊断方法。
[0007]所述解脲支原体抗原金标快速检测试剂盒，其使用方法包括下述步骤:取女性宫颈样本或男性尿道样本与样品处理液混匀，再将混合液滴加于检测试剂盒的加样孔中，3^15分钟即可判读检测结果。若样品溶液中含有解脲支原体MB蛋白，则观察窗处检测线(C线)和质控线(T线)均显色，结果判定为阳性；若样品溶液中不含解脲支原体MB蛋白，则观察窗处仅质控线(C线)显色，结果判定为阴性。
[0008]所述解脲支原体抗原金标快速检测试剂盒，由解脲支原体抗原金标快速检测条、塑料卡盒和样品处理液组成。
[0009]所述解脲支原体抗原金标快速检测条，包括样品垫a、胶体金垫、样品垫b、硝酸纤维素膜、吸样垫、衬板；检测条是在衬板上依次设有样品垫a、硝酸纤维素膜、吸样垫；在胶体金垫下有样品垫a，在胶体金垫上有样品垫b ;在硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线。
[0010]所述解脲支原体抗原金标快速检测试剂盒塑料卡盒，其特征在于塑料卡盒盖上依次有加样孔和观察窗，塑料卡盒盖靠近观察窗设有产品简称和样本编号，观察窗上设有结果判别标识T和C ;塑料卡盒底部设有的单卡槽；塑料卡盒盖和盒底通过凸起连接。
[0011]所述解脲支原体抗原金标快速检测条安装在塑料卡盒底部的单卡槽内，样品垫b和胶体金垫对应塑料卡盒的加样孔处，所述硝酸纤维素膜对应塑料卡盒观察窗处，所述检测线和质控线分别对应观察窗的T线和C线。
[0012]所述解脲支原体抗原金标快速检测试剂条胶体金垫标记物为解脲支原体MB蛋白单克隆抗体b，胶体金的载体为无纺布或玻璃纤维。
[0013]所述解脲支原体抗原金标快速检测条，其特征在于质控线包被羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG抗体。
[0014]所述解脲支原体抗原金标快速检测条，其特征在于检测线包被解脲支原体MB蛋白单克隆抗体a。
[0015]所述解脲支原体抗原金标快速检测条，其特征在样品垫a/b为无纺布。
[0016]所述解脲支原体抗原金标快速检测条，其特征在于吸样垫为吸水滤纸。
[0017]所述解脲支原体抗原金标快速检测试剂盒的检测卡盒设有连接装置，盒盖和盒底可拆卸式连接，一方面盒盖和盒底可重复使用，节省资源。
[0018]所述解脲支原体抗原金标快速检测条，其胶体金垫的制备方法如下:i胶体金的制备:在浓度为0.004%~0.012%的氯金酸中加入其体积的1.3%~2%、浓度为1%~3%的柠檬酸三钠，煮沸10-20分钟，可得到15~50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记解脲支原体MB蛋白单克隆抗体b:将(i)中所得胶体金溶液中用0.2M碳酸钾溶液调pH至8.0-8.4，按4"l2mg/100ml加入解脲支原体MB蛋白单克隆抗体b,搅拌均匀后,按0.1 "0.6g/100ml在溶液中加入动物血清蛋白，4°C静置2~4小时；iii将(ii)中所得胶体金溶液经2000转/分钟离心10-15分钟，去沉淀物，取上清液；iv将(iii)中所得上清液经10000转/分钟离心60~80分钟，取上清液，取沉淀物；v将(iv)中所得沉淀物按4~10ml/100ml溶于0.02M pH7.4 Tris-Hcl缓冲液(该缓冲液中含0.2%~0.6%的动物血清蛋白和0.ΟΡ/1-Ο.06%叠氮钠)中，得胶体金溶液；vi将玻璃纤维或无纺布浸入(V)中所得胶体金溶液中，待浸入的玻璃纤维或无纺布有液体渗出为止，37°C干燥，即得胶体金垫。
[0019]所述解脲支原体抗原金标快速检测条，其质控线和检测线的包被方法如下:取解脲支原体MB蛋白单克隆抗体a，调浓度为lmg/ml，加入适量甲醛，用专用喷膜机在NC膜中段喷检测线；取羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG抗体，调浓度为2mg/ml，加入适量甲醛，用专用喷膜机在NC膜中段，距检测线0.5cm处喷质控线(11)，检测线和质控线均按10-20 μ Ι/ml设置喷量，喷膜后37°C条件下干燥2小时；在37°C条件下，用含10%小牛血清的0.01M pH 7.0PBS液(磷酸盐缓冲溶液)封闭30分钟，用0.01M pH 7.0 PBS漂洗，37°C干燥，即得。
[0020]所述解脲支原体抗原金标快速检测试剂盒，其特征在于所用样品处理液包括样品处理液A和样品处理液B，样品处理液A为0.01M pH7.2的磷酸盐缓冲溶液，样品处理液B为0.9%的氯化钠溶液。
[0021]所述解脲支原体抗原金标快速检测条采用免疫层析技术和抗原抗体特异性结合原理。本产品以胶体金标记解脲支原体MB蛋白单克隆抗体b,以解脲支原体MB蛋白单克隆抗体a、羊抗鼠IgG抗体分别包被硝酸纤维素膜的检测线(T线)和质控线(C线)，当待测样品中含有解脲支原体MB蛋白时，通过毛细作用向前移动，与胶体金标记物相结合形成待测物胶体金标记复合物，在移动至解脲支原体MB蛋白单克隆抗体包被区时，待测物胶体金标记复合物与之发生特异性结合而被截留，形成肉眼可观察的红色条带；待测物胶体金标记复合物继续向前移动，与包被在质控线(C线)上的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG抗体结合，形成红色条 带。无论待测样本中是否存在解脲支原体MB蛋白，质控线上包被的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG抗体都会与胶体金标记的解脲支原体MB蛋白单克隆抗体b结合形成一条红色线(C线)。C线的显色是判定是否有足够样本，层析过程是否正常的标准，同时也作为该检测卡的内部质控标准。若硝酸纤维素膜上质控线和检测线均不出现，则检测结果无效。
[0022]本实用新型使用以上技术方案，提供了一种解脲支原体抗原金标快速检测试剂盒。本实用新型操作简便、使用方便快捷、无需专门的设施，且能满足临床样本快速检测、体检、流行病学普查等的要求，容易普及到基层医院。以符号显示结果，结果观察更为直观、快捷，同时也摆脱了对仪器设备、人员的特殊要求，缩短了检测时间，提高了检测效率，具有准确、快捷、方便、价廉的特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1是本实用新型检测卡的立体结构示意图:
[0024]I 一检测卡盒 2—加样孔3—观察窗
[0025]4 一样品编号 5—广品简称。
[0026]图2是本实用新型检测卡盒盖的结构示意图:
[0027]2 一加样孔3—观察窗6—凸起。
[0028]图3是本实用新型检测卡盒底的结构示意图:
[0029]6—凸起7—单卡槽。
[0030]图4本实用新型检测卡中检测条的结果示意图:
[0031]8—检测条9一样品垫a10—胶体金垫
[0032]11 一样品塾b 12—硝酸纤维素膜13—检测线[0033]14 一质控线15—吸样垫16—衬板。
【具体实施方式】
[0034]提供下述实施例是为了能更好的理解本实用新型，并不局限于所述最佳实施方式，任何人在本实用新型的启示下或是将本实用新型与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本实用新型相同或相似的产品，均落在本实用新型的保护范围之内。
[0035]本实用新型用于检测解脲支原体抗原，用于临床样本快速检测、体检、流行病学普查等。结果观察更为直观、快捷，摆脱了对仪器设备、人员的特殊要求，缩短了检测时间，提高了检测效率，具有操作简便、使用方便、无需专门的设施、准确、快捷、方便、价廉的特点。
[0036]所述解脲支原体抗原金标快速检测试剂盒，其使用方法包括下述步骤:取女性宫颈样本或男性尿道样本与样品处理液混匀，再将混合液滴加于检测卡的加样孔中，3~15分钟即可判读检测结果。若样品溶液中含有解脲支原体MB蛋白，则观察窗处检测线(C线)和质控线(T线)均显色，结果判定为阳性；若样品溶液中不含解脲支原体MB蛋白，则观察窗处仅质控线(T线)均显色，结果判定为阴性。
[0037]本实用 新型的解脲支原体抗原金标快速检测试剂盒，包括解脲支原体抗原金标快速检测条、塑料卡盒和样品处理液。
[0038]所述解脲支原体抗原金标快速检测条(8)，包括样品垫a (9)、胶体金垫(10)、样品垫b (11)、硝酸纤维素膜(12)、吸样垫(15)、衬板(16);检测试剂条是在衬板(16)上依次设有样品垫a (9)、胶体金垫(10)、硝酸纤维素膜(12)、吸样垫(15);在胶体金垫(10)上有样品垫b (11);在硝酸纤维素膜(12)上包被有检测线(13)和质控线(14)。具体操作如下:在衬板(16)中部粘贴包被检测线(13)和质控线(14)的硝酸纤维素膜(12)，样品垫a (9)位于硝酸纤维素膜(12)的一侧，并与其有部分重叠；在样品垫a (9)上设有胶体金垫(10)，在胶体金垫(10)上设有样品垫b (11)，并使胶体金垫(10)和样品垫b (11)与硝酸纤维素膜(12)有部分重叠，在硝酸纤维素膜(12)的另一侧粘贴有吸样垫(15)，且与硝酸纤维素膜
(12)也有部分重叠，固定。然后按4-5毫米宽、8厘米长规格切条。参考附图4。
[0039]所述解脲支原体抗原金标快速检测条制备方法主要包括胶体金垫(10)的制备和硝酸纤维素膜(12)上检测线(13)和质控线(14)的包被。
[0040]所述解脲支原体抗原金标快速检测条，其胶体金垫(10)其制备方法包括以下步骤:i胶体金的制备:取IOOmg氯金酸溶于1000ml三蒸水中，加入15ml、在浓度为1%的朽1檬酸三钠，煮沸15分钟，可得到15~50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记解脲支原体MB蛋白单克隆抗体:取(i)中所得胶体金溶液100ml，用0.2M碳酸钾溶液调pH至8.2，加入4mg解脲支原体MB蛋白单克隆抗体，搅拌20分钟后，在溶液中加入240mg牛血清白蛋白，继续搅拌5分钟，4°C静置4小时；iii将(ii)中所得胶体金溶液经2000转/分钟离心15分钟，去沉淀物，取上清液；iv将(iii)中所得上清液经10000转/分钟离心60分钟，取上清液，取沉淀物；V将(iv)中所得沉淀物按5ml/100ml溶于0.02M pH 7.4 Tris-Hcl缓冲液(该缓冲液中含0.25%的牛血清白蛋白和0.02%叠氮钠)中，得胶体金溶液；vi将无纺布浸Λ(ν)中所得胶体金溶液中，待浸入的无纺布有液体渗出为止，37°C干燥2小时，即得。
[0041]所述解脲支原体抗原金标快速检测条，其检测线(13)和质控线(14)的包被方法为:取解脲支原体MB蛋白单克隆抗体a，调浓度为lmg/ml，加入0.2%甲醛，用专用喷膜机在NC膜中段喷检测线(13);取羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG抗体调浓度为2mg/ml，加入0.2%甲醛，用专用喷膜机在NC膜中段，距检测线0.5cm处喷质控线(14)，检测线和质控线均按20 μ I/ml设置喷量，喷膜后37°C条件下干燥2小时；在37°C条件下，用含10%小牛血清的0.0lMpH 7.0 PBS液(磷酸盐缓冲溶液)封闭30分钟，用0.0lM pH 7.0 PBS漂洗，37°C干燥，即得。
[0042]所述解脲支原体抗原金标快速检测条安装在塑料卡盒底部的单卡槽内，样品垫b
(11)和胶体金垫(10)对应塑料卡盒的加样孔(2)处，所述硝酸纤维素膜(12)对应于塑料卡盒观察窗处，所述检测线(13)和质控线(14)分别对应于观察窗(3)的T线和C线。
[0043]所述样品垫a/b (9/11)为无纺布；所述胶体金垫(10)标记抗体为解脲支原体MB蛋白单克隆抗体b ;所述质控线(14)包被的抗体为羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG抗体；所述检测线(13)包被的抗体为解脲支原体MB蛋白单克隆抗体a ;所述吸样垫(15)为吸水滤纸；所述衬板(16)为PVC胶板。
[0044]所述解脲支原体抗原金标快速检测试剂盒，其特征在于所用样品处理液包括样品处理液A和样品处理液B，样品处理液A为0.0lM pH7.2的磷酸盐缓冲溶液，样品处理液B为0.9%的氯化钠溶液。
[0045]所述解脲支原体抗原金标快速检测试剂盒采用免疫层析技术和抗原抗体特异性结合原理。其具体使用方法如下:1将样品处理液A液，滴6滴(300ul)加入样品处理管中。II将样品拭子放入滴有样品稀释液A液的处理管内，室温2分钟，在处理过程中要多次旋转并在管壁上挤压拭子，使液体不断被挤出。III 2分钟后加入6滴(300ul)样品处理液B液，在管壁挤压拭子，使液体尽量挤出，随后将拭子丢弃在密封的医疗垃圾容器内，按有关规定进行处置。IV撕开铝箔袋取出测试板平放，用吸管滴加约2滴处理好的样品液在测试板右端的圆加样孔中，3?5分钟后观察测试板中部检视窗的结果，20分钟内观察结果有效。当待测样品溶液中含有解脲支原体MB蛋白时，通过毛细作用向前移动，与胶体金标记物相结合形成待测物胶体金标记复合物，在移动至解脲支原体MB蛋白单克隆抗体a包被区时，待测物胶体金标记复合物与之发生特异性结合而被截留，形成肉眼可观察的红色条带；待测物胶体金标记复合物继续向前移动，与包被在质控线(C线)上的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG抗体结合，形成红色条带，则结果为阳性；当待测样品溶液中含有解脲支原体MB蛋白时，只在质控线(C线)上出现红色条带。无论待测样本中是否存在解脲支原体MB蛋白，质控线上包被的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG抗体都会与胶体金标记的解脲支原体MB蛋白单克隆抗体b结合形成一条红色线(C线)。C线的显色是判定是否有足够样本，层析过程是否正常的标准，同时也作为该检测卡的内部质控标准。若反应膜上质控线线和检测线均不出现，则检测结果无效。
[0046]本实用新型操作简便、使用方便快捷、无需专门的设施，且能满足临床样本快速检测、体检、流行病学普查等的要求，容易普及到基层医院。以符号显示结果，结果观察更为直观、快捷，同时也摆脱了对仪器设备、人员的特殊要求，缩短了检测时间，提高了检测效率，具有准确、快捷、方便、价廉的特点。
【权利要求】
1.一种解脲支原体抗原金标快速检测试剂盒，包括检测条和塑料卡盒；检测条由样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫和衬板组成，样品垫a、胶体金垫、样品垫b、硝酸纤维素膜、吸样垫，由下到上依次粘贴在衬板上；在硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线；塑料卡盒由盒盖与盒底组成，盒盖上设有加样孔和观察窗，正面靠近观察窗处标注有产品说明文字，盒底内面设有的卡槽，盒盖与盒底通过凹凸连接；检测条安装在塑料卡盒底部的卡槽内，样品垫b对应塑料卡盒的加样孔处，硝酸纤维素膜对应塑料卡盒观察窗处，检测线和质控线分别对应塑料卡盒观察窗T和C标示处。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述胶体金垫为固化胶体金标记解脲支原体MB蛋白单克隆抗体b的无纺布或玻璃纤维；所述检测线上包被解脲支原体MB蛋白单克隆抗体a，所述质控线上包被的抗体为羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG抗体。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述样品垫a和样品垫b为无纺布；所述吸样垫为吸水滤纸；所述衬板为PVC胶板。
【文档编号】G01N33/577GK203772870SQ201320634463
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年10月15日
【发明者】李克生, 杜惠芬 申请人:李克生, 杜惠芬