对alk抑制剂具有先抗性或后抗性癌症的识别，判断和治疗的制作方法
【专利摘要】本发明公开了那些能确定对象所患的癌症是否对ALK突变成阳性，和/或患有这种癌症的患者是否会有一个相对缓慢的疾病恶化过程的化合物，试剂盒和方法，所述的ALK突变可能在一种ALK抑制剂治疗后产生反应。本发明还公开了那些能预测患有这种癌症的患者其病情随时间发展的进程。
【专利说明】对ALK抑制剂具有先抗性或后抗性癌症的识别，判断和治疗
[0001]本分案申请是发明名称为“对ALK抑制剂具有先抗性或后抗性癌症的识别，判断和治疗”，申请号为2011800058134，申请日为2011年2月4日的原始发明专利申请的分案申请。
[0002]相关申请
[0003]本申请权利要求2010年02月04日申请的申请序号为61/337，465的美国临时申请的优先权。
[0004]发明背景
[0005]酪氨酸激酶是一类通过转移末端三磷酸腺苷来催化蛋白质底物上的酪氨酸残基磷酸化的酶。在许多情况下，酪氨酸激酶在细胞功能包括细胞增殖，癌变和细胞分化的信号转导方面具有关键作用。
[0006]EML4-ALK是一种融合型蛋白酪氨酸激酶，在5%的非小细胞肺癌(NSCLC)病例中出现，其可引起人类2号染色体短臂的微小倒位的结果(Soda, M.et al.(2007)Nature448:561-566; Mano, H.(2008) Cancer Sc1.99:2349-2355)。EML4 - ALK 是通过每个单体EML4在卷曲螺旋结构域中相互作用而造成的二聚结构体，从而获得明显的致癌活性。用转基因老鼠来表达EML4 - ALK，特别是肺上皮细胞，出生后不久就在双肺上生成了许许多多的腺癌小瘤，然后在 给予口服特效的ALK酪氨酸激酶活性抑制剂后这些小瘤迅速地从肺上消除(Soda，M.et al.(2008)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA105:19893-19897)。这些观察表明，在NSCLC癌变中EML4 - ALK具有生成这种融合激酶的重要作用，并进一步证明用ALK抑制剂来分子靶向治疗癌症的可行性。例如，临床验证，抑制剂PF-02341066，对ALK和MET都具有酪氨酸激酶活性，在对EML4-ALK的阳性NSCLC进行治疗，其间歇性结果较理想(Kwak，E.L.et al.(2009) J.Clin.0ncol.27 (suppl):15s (abstract3509))。然而，EML4-ALK 的阳性肿瘤对治疗失败的未知分子成份的抑制剂没有响应。
[0007]除了 PF-02341066，其他酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)已被证明在对癌症患者治疗具有显的活性。甲磺酸伊马替尼，一种用于ABLl和KIT的TKI，例如，BCR-ABLl融合型激酶的阳性慢性骨髓性白血病或KIT的阳性胃肠道间质肿瘤的个案中具有明显的改善效果(Druker, B.J.et al.(2001)N.Engl.J.Med.344:1031-1037 ;Heinrich, M.C.etal.(2008)J.Clin.0ncol.26:5360-5367)。此外，吉非替尼和厄洛替尼，都是表皮生长因子受体(EGFR)的TKIs，在治疗EGFR活性的NSCLC中具有效果(Mok，T.S.et al.(2009)J.Clin.0ncol.27:5080-2087 ;Mok, T.S.et al.(2009)N.Engl.J.Med.361:947-957)。遗憾的是，肿瘤的靶向群要么从治疗开始就对相应的TKIs难以融合要么在开始响应后就产生耐药性。其次，在一些失败的案例中还发现肿瘤靶向激酶直接发生突变或变构影响ATP-结合组织的形状，从而导致影响TKI的结合(Deininger，M.et al.(2005)Bloodl05:2640-2653 ; Kobayashi, S.et al.(2005) N.Engl.J.Med.352:786-792; Pao, ff.etal.(2005)PLoS Med.2:e73;Shah, N.P.et al.(2002)Cancer Cell2:117-125)。因此，迫切需要能识别出在酪氨酸激酶上的具有抗突变的位置，如EML4-ALK，以便更好的发展用于识另|J、判断，预防和治疗相关异常和/或活性表达的疾病的化合物，试剂盒和方法。
【发明内容】
[0008]本发明至少提供了通过识别出对公知的ALK抑制剂产生抗性的新型的间变性淋巴瘤激酶(ALK)突变而识别、判断和治疗癌症的化合物，方法和试剂盒。同样，这些ALK突变能够在临床上鉴定药物组合物，这些药物组合物可以放入那些由新型ALK突变产生的异常ATP-结合区，来抑制ALK活性。
[0009]一方面，本发明提供了一种用于识别一个患有癌症或具有罹患癌症风险的对象在使用ALK抑制剂治疗时是否会产生对治疗无反应的额外风险的方法，其包括从患者身上采集样本并分析样本来检查是否存在一个或多个突变的ALK多核苷酸分子，其中存在一个或多个突变的ALK多核苷酸分子表明对象已经具有对ALK抑制剂治疗无反应的额外风险。
[0010]另一个方面，本发明提供了一种用于识别一个患有癌症或具有罹患癌症风险的对象在使用ALK抑制剂治疗时是否会产生对治疗无反应的额外风险的方法，其包括从患者身上采集样本并分析样本来检查一个或多个突变的ALK多肽的表达水平、结构和/或活性，其中存在一个或多个突变的ALK多肽表明对象已经具有对ALK抑制剂治疗无反应的额外风险。
[0011]在本发明的一 些实施例中，对象可以是之前没有使用一种ALK抑制剂来治疗，也可以是之前已经经用一种ALK抑制剂治疗，并至少部分地对ALK抑制剂(如PF-02341066，roD，2-甲基-11-(2-甲基丙基)-4-氧-4，5，6，11，12，13-六氢-2H-吲唑[5，4-α ]吡咯[3，4_c]咔唑-8-基[4- (二甲氨基)苄基]氨基甲酸甲酯，(13，25，31?，410-3-({5-氯-2-[(1-乙基-2，3，4，5-四氢-6-甲氧基-2-氧-1H-1-苯并氮杂卓_7_基)氨基]_4_嘧啶}氨基)双环[2.2.1]庚-5-烯-2-甲酰胺和NVP-TAE684)产生了抗性。在另一些实施例中，所述的癌症包括间变性大细胞淋巴瘤，神经母细胞瘤，乳腺癌，大肠癌，炎性肌纤维瘤，非小细胞肺癌。还有另一些实施例中，所述的样本包括痰液，支气管肺泡灌洗，胸腔积液，组织，全血，血清，血浆，口腔刮，唾液，脑脊液，尿液，粪便，循环肿瘤细胞，循环核酸和骨髓等。
[0012]在还有另一些实施例中，所述的样本包括细胞或组织。在一些实施例中，组织是肿瘤或癌组织。在另一些实施例中，一个或多个突变的ALK多核苷酸分子或多肽包括如表1所列的突变ALK多核苷酸分子或多肽。还有一些实施例中，一个或多个突变的ALK通过核酸杂交法来判断。在另一些实施例中，一个或多个突变的ALK通过聚合酶链反应来判断。在另一些实施例中，一个或多个ALK多肽表达水平用特异性结合到一个或多个ALK多肽(如抗体，抗体衍生物，和抗体片段)的试剂来查明。在还有一些实施例中，一个或多个ALK多肽的数量，结构和/或活性与控制样本相比较。在还有一些实施例中，一个或多个突变的ALK通过启始点的时间和至少一个随后点的时间来判断。在另一些实施例中，样本包括生殖细胞或体细胞基因组DNA。
[0013]另一个方面，本发明还提供了一种治疗癌症患者或有潜在的癌症患者的方法，包括从患者身上收集样本，分析样本来查明是否存在一个或多个如表1所列的突变ALK多核苷酸分子，然后给所述病人使用一个治疗有效的ALK抑制剂。在一些实施例中，ALK抑制剂包括
[0014]PF-02341066, PDD, 2-甲基-11- (2-甲基丙基)-4-氧-4，5，6，11，12，13-六氢-2H-吲唑[5，4-α]吡咯[3，4-c]咔唑_8_基[4- (二甲氨基)苄基]氨基甲酸甲酯，
[0015](IS, 2S, 3R, 4R) -3-((5-氣-2-[(l-乙基-2,3,4,5-四氧-6-甲氧基-2-氧-1H-1-苯并氮杂卓-7-基)氨基]-4-嘧啶}氨基)双环[2.2.1]庚-5-烯-2-甲酰胺和NVP-TAE684。在另一些实施例中，对象可以是之前没有使用一种ALK抑制剂来治疗，也可以是之前已经经用一种ALK抑制剂治疗，并至少部分地对ALK抑制剂产生了抗性。
[0016]另一个方面，本发明还提供了一种用于确定一个癌症患者的化学敏感性，从而使用一种ALK抑制剂进行治疗的试剂盒，包括:一种与一个或多个突变的ALK多核苷酸分子或多肽产生特定结合的试剂；和使用说明书。在一些实施例中，该试剂盒还包括一种ALK抑制剂。在另一些实施例中，该试剂包括一个或多个多核苷酸探针，每个探针包括一个多核苷酸序列，这个多核苷酸序列与表1所列的其中一个核苷酸序列互补，或者与一个编码表1所列的其中一个多肽的核苷酸序列互补(例如寡核苷酸，cRNA分子，RNA分子和由碱基组成的合成基因探针)。还有一些实施例中，探针包括长度约为50至IO7个核苷酸的多核苷酸。有还有一些实施例中，试剂包括一种由表1所列的一个或多个核苷酸序列编码而成的一种抗体，抗体衍生物和抗体片段到一种多肽。
[0017]另一个方面，本发明还提供了一种方法来确定一种检测化合物是否控制了一个或多个突变ALK多肽的活性，包括与哺乳动物细胞接触，使其转染一个结构，并用检测化合物来编码一个或多个突变的ALK多肽，并测定该哺乳动物细胞来确定一个或多个突变的ALK多肽的活性，其中由于被检测化合物能在一个控制表达中显著地调节活性，因此它可以作为一个或多个突变ALK多肽的调节器。在一些实施例中，所述的一个或多个突变的ALK多核苷酸分子或多肽包括表1所列的突变ALK多核苷酸分子或多肽。在另一些实施例中，所述的控制包括哺乳动物细胞表达一种野生型ALK多肽，多肽可以是表1所列的多肽。在另一些实施例中，一个或多个突变ALK多肽的活性可以是ATP结合，酪氨酸激酶活性，癌症细胞增殖，肿瘤生长，肿瘤 数量，细胞凋亡和肿瘤转移。在另一些实施例中，所述的控制表达包括哺乳动物细胞在检测化合物的存在下，表达一个或多个突变ALK多肽，其中可以例如用一个或多个突变ALK多肽的活性(例如ATP结合，酪氨酸激酶活性，癌症细胞增殖，肿瘤生长，肿瘤数量，细胞凋亡和肿瘤转移)来确定检测化合物的存在。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1所示的是本发明所述的能抗ALK酪氨酸激酶抑制剂的新型ALK突变。图1A是EML4-ALK蛋白的结构示意图。图中显示了激酶结构域中两个de novo突变的位置，并用实心或空心箭头分别图示了上述用于扩增激酶结构域或融合cDNA的那些PCR引物。图1B显示了 ALK激酶结构域cDNA的深度测序结果。NSCLC细胞系H2228或编号为J-#l, J-#12, J-#113, J-#127或LK-#33的样本中获得的约1000bp的PCR产物是用GAII系统测序的。激酶结构域cDNA的每个位置上的总读数(总)和错配读数(错配)的数目分别用蓝色和红色菱形表示。并放大地显示了样本J_#l和J_#113中CDNA5’端处的插入(用绿色方块表示)。图1C是G4374和C4493周围ALK cDNA克隆的电泳图。PCR是用cDNA来完成的，所述的cDNA分别是从未治疗前采样的痰中(开始)和已经恶化后采样的胸腔积液细胞中(恶化)提取的。取代的A核苷酸用红色显示。
[0019]图2图示了 ALK cDNA中G4374和C4493对应位置处的基因序列。病患的胸腔积液细胞中分离出来的基因DNA可以用PlatinumODNA聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA),下述引物(5，-GGTAAGAAGTGGCTCACTCTTGAG-3’ 和 5’ -CACAACAACTGCAGCAAAGACTGG-3’)进行PCR，94°C下15s，60°C下30s，68 °C下2分钟，35个循环，获得的产物导入到质粒pT7Blue-2 (Takara Bio)中。然后将插入后的质粒用3130x1基因分析仪测序，以鉴别含有G4374A(图左侧)or C4493A(图右侧)取代的PCR克隆。取代的A核苷酸用红色显示。
[0020]图3显示了用PF-02341066处理BA/F3细胞的结果。BA/F3表达了 EML4-ALK (野生型)，EML4-ALK(C1156Y)，EML4_ALK(L1196M)，或双突变的 EML4_ALK(C1156Y/L1196M)，它是在所示浓度的PF-02341066中培养48小时，然后用相差显微镜来观察其细胞形态。比例尺:20ymo图4显示了本发明所述的能抗ALK酪氨酸激酶抑制剂的新型ALK突变的性能。图4Α显示了 5父105个84作3细胞在PF-02341066的所示浓度下培养48h后表达EML4-ALK (野生型)，EML4-ALK(C1156Y)，EML4_ALK(L1196M)或双突变 EML4_ALK(C1156Y/L1196M)的数量。图中显示了 BA/F3表达野生型EML4-ALK相对的可用细胞的百分比。数据是指三个单独实验获得的土 s.d.。图4B显示了在野生型的酪氨酸磷酸化作用中或者突变型EML4-ALK中PF-02341066的效果。BA/F3细胞表达了 FLAG标记的野生型EML4-ALK或其突变，将其置于所示浓度的PF-02341066中15小时，然后EML4-ALK从细胞溶解产物中免疫沉淀出来，然后进行免疫印迹分析抗体对Tyr16tl4磷酸化的ALK或FLAG表位(ALK).的特异性。将表达一种EML4-ALK(KM)不活跃突变的细胞作为阴性对照。图4C显示了一种体外激酶评估，它能用于评估从BA/F3细胞(未转入ALK抑制剂中)中免疫沉淀出来的FLAG标记的野生型EML4-ALK或其突变。所述的免疫沉淀是在[Y-32P]ATP，一种合成肽和所述浓度的PF-02341066中进行的。肽底物免疫沉淀的磷酸化作用分别用于免疫印迹分析抗体抗FLAG的性能(图下侧)。
[0021]图5是ALK激酶结构域的三维结构域模型图。ALK的氨基酸位置是重叠在胰岛素受体的晶体结构上，该胰岛素受体有一个结合的ATP同源物(日本蛋白信息银行中的编号为“lir3”，可以在pdbj.0rg/index.html的万维网上查询)。右侧图显示了从左侧所示的模型左侧获得的蛋白结构 。A螺旋和β折叠分别用红色和黄色来表示。图中还显示了螺旋aC, Cys1156, andLeu1196 的位置。
[0022]发明详述
[0023]本发明至少有部分内容是识别特定基因序列，包括如间变性淋巴瘤激酶(ALK)突变，然后判定ALK抑制剂是否能有效地治疗癌症。尤其是在本发明中，已经识别出的新型ALK基因突变(如EML4-ALK多肽编码的突变)会使多肽至少能部分地对ALK抑制剂疗法产生抗性。本发明还公开了那些使用本领域的公知技术来识别这些特定基因序列的方法，这些方法非限制性地包括寡核苷酸基因芯片(Brennan, et al.(2004)CancerRes.64(14):4744-8;Lucito, et al.(2003)Genome Res.13:2291-2305;Bignell etal.(2004)Genome Res.14:287-295;Zhao, et al(2004)Cancer Research, 64(9):3060-71)和本发明所述的其它方法，例如包括聚合酶链式反应(PCR)和直接测序法。本发明还公开了这些方法中使用的诊断试剂盒。
[0024]本发明所述的其它方面将在下文中进一步详细说明。
[0025]1.定义
[0026]本文中的“一个”和“一种”指一种或一种以上(如至少一种)的语法对象。例如，“一种成分”即一种成分或一种以上的成分。[0027]术语标记的“变化量”或标记的“变化水平”涉及标记或染色体区增加或减少的拷贝数，如ALK基因突变和/或基因产物(如表1所列的标记)，和/或在一个癌症样本中，一个或一些特定标记基因与在一个控制样本中，与标记拷贝量的表达水平相比，增加或减少的表达量。术语标记的“可选量”也包括在一个如癌症样本等样本中，一个标记与正常控制样本中的标记蛋白质水平相比，增加或减少的蛋白质水平。
[0028]术语ALK基因突变和/或基因产物(如表1所列的标记)的“变化的表达水平”是指在一个检测样本，如从一个病症患者身上采集的样本中涉及一个标记的表达水平或拷贝数，它们大于或小于标准错误试验的表达水平或拷贝数，可以至少是一个控制样本(如从一个未患癌症的健康对象身上采集的样本)中ALK基因突变和/或基因产物(如表1所列的标记)的表达水平或拷贝数的两倍，两三倍，二四倍，二五倍或二十倍或更多倍，或者是在各种控制样本中，ALK基因突变和/或基因产物(如表1所列的标记)的平均表达水平或拷贝数。变化的表达水平大于或小于标准错误试验的表达水平或拷贝数，可以至少是一个控制样本(如从一个未患癌症的健康对象身上采集的样本)中ALK基因突变和/或基因产物(如表1所列的标记)的表达水平或拷贝数的两倍，三倍，四倍，五倍或十倍或更多倍，或者是各种控制样本中，ALK基因突变和/或基因产物(如表1所列的标记)的平均表达水平或拷贝数。
[0029]术语标记的“变化活性”涉及一个标记的活性，在生病状态时，如一个癌症样本里会比正常控制样本中的标记活性更高或更低。标记的变化活性可以是例如由标记的表达变化，标记的蛋白质水平变化，标记的结构变化，如与其它在相同或不同的路径中作为标记的蛋白质发生一个 化的反应而引起的。
[0030]术语标记的“结构变化”涉及突变的存在，或者是标记基因或标记蛋白质的突变，如较之正常或野生型基因或蛋白质，影响标记表达或活性的突变。例如，突变非限制性地包括插入和内部染色体重组，替换，删除和插入突变。突变可以在标记的编码区或未编码区发生。
[0031 ] 本发明中，“间变性淋巴瘤激酶”和“ALK”是同一个含意，均指任何来源(如啮齿类动物，人类和其他哺乳动物)的原生间变性淋巴瘤激酶和它的一些变化和突变。在一些实施例中，ALK蛋白质由参考序号识别号NPJKM295的NCBI表达。除了识别之外，该术语还涉及人体蛋白。在本发明中，所述的基因编码ALK也可以称为“ALK”。在一些实施例中，ALK核苷酸序列可以由参考序号识别号NM_004304.3和的NCBI和GenBank登录号为29029631表达，本领域的普通技术人员能简单地识别本发明相关的序列(如编码，5’端非编码区，3’端非编码区，转录启动，翻译启动，转录停止，翻译停止等序列)。
[0032] 此外在本发明中，“间变性淋巴瘤激酶”和“ALK”还包括本领域普通技术人员公知的ALK融合蛋白激酶及其各种突变体。这些ALK融合蛋白激酶及其各种突变体包括ALK蛋白激酶活性，并将本发明所述的突变翻译成抗ALK抑制剂的ALK蛋白激酶活性。典型的实例包括 EML4-ALK 突变 1(ΑΒ274722.1;BAF73611.1)，EML4-ALK 突变 2 (AB275889.1; BAF73612.1)，EML4-ALK 突变 3a(AB374361.1;BAG55003.1)，EML4-ALK 突变 3b (AB374362.1; BAG55004.1)，EML4-ALK 突变 4(ΑΒ374363.1;BAG75147.1)，EML4-ALK 突变 5a (ΑΒ374364.1; BAG75148.1)，EML4-ALK 突变 5b(AB374365.1;BAG75149.1)，EML4-ALK 突变 6 (AB462411.1; BAH57335.1)，EML4-ALK 突变 7 (AB462412.1; BAH57336.1)，KIF5B-ALK (AB462413.1; BAH57337.1)，NPM-ALK, TPM3-ALK, TFGXL-ALK, TFGL-ALK, TFGS-ALK, ATIC-ALK, CLTC-ALK, MSN-ALK, TPM4-ALK，MYH9-ALK，RANBP2-ALK，AL017-ALK 和 CARS-ALK (例如参见 Pulford et al.，(2004)J.Cell.Physiol.199:330-358，本发明引用参考)。此外，本领域的普通技术人员明白一种ALK激酶与其融合体发生的特别融合能使ALK蛋白激酶突变增加(如EML4至少能与外显子2,6a, 6b, 13, 14 和 / 或 15 融合，例如如 Horn and Paoj (2009) J.Clin.0ncol.27:4247-4253所述，本发明引用参考)。例如，下面是本发明所述的典型ALK序列:
[0033]表1
[0034]野生型ALK cDNA 序列(NM_004304.3 ；G1: 29029631):
【权利要求】
1.一种用于识别一个患有癌症或具有罹患癌症风险的对象在使用ALK抑制剂治疗时是否会产生对治疗无反应的额外风险的方法，其特征在于包括: a.从对象身上采集一个样本；且 b.分析这个样本，检测是否有一个或多个突变的ALK多核苷酸分子， 其中一个或多个突变的ALK多核苷酸分子的存在说明该患者具有一个对ALK抑制剂治疗无反应的额外风险。
2.一种用于识别一个患有癌症或具有罹患癌症风险的对象在使用ALK抑制剂治疗时是否会产生对治疗无反应的额外风险的方法，其特征在于包括: a.从对象身上采集一个样本；且 b.分析这个样本，检测一个或多个突变的ALK多肽的表达水平，结构和/或活性， 其中一个或多个突变的ALK多肽的存在说明该患者具有一个对ALK抑制剂治疗无反应的额外风险。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的患者事先没有使用一种ALK抑制剂进行治疗，或者事先已 经使用了一种ALK抑制剂进行治疗，并对ALK抑制剂已经至少产生了一部分的抗性。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的癌症包括间变性大细胞淋巴瘤，神经母细胞瘤，乳腺癌，大肠癌，炎性肌纤维瘤和非小细胞肺癌。
5.如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述的ALK抑制剂包括PF-02341066, PDD, 2-甲基-11- (2-甲基丙基)-4-氧-4，5，6，11，12，13-六氢-2H-吲唑[5，4-α]吡咯[3，4-c]咔唑_8_基[4_ (二甲氨基)苄基]氨基甲酸甲酯，(IS，2S, 3R, 4R) -3- ({5-氣-2- [ (1-乙基-2，3, 4, 5-四氧-6-甲氧基-2-氧-1H-1-苯并氣杂卓-7-基)氨基]-4-嘧啶}氨基)双环[2.2.1]庚-5-烯-2-甲酰胺和NVP-TAE684。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的样本包括痰液，支气管肺泡灌洗，胸腔积液，组织，全血，血清，血浆，口腔刮，唾液，脑脊液，尿液，粪便，循环肿瘤细胞，循环核酸和骨髓。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的样本是组织，并且所述的组织是一种肿瘤或癌症组织。
8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的样本包括细胞。
9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的一个或多个突变的ALK多核苷酸分子或多肽包括表1所列的突变ALK多核苷酸分子或多肽。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于使用一种核苷酸杂交检测来检测一个或多个ALK突变。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于使用一种聚合酶链式反应来检测一个或多个ALK突变。
12.如权利要求2所述的方法，其特征在于使用一种试剂来检测一个或多个ALK多肽的表达水平，其中所述的试剂是与一个或多个ALK多肽形成特定结合的。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于所述的试剂包括一种抗体，一种抗体衍生物和一种抗体片段。
14.如权利要求2所述的方法，其特征在于将一个或多个突变ALK多肽的数量，结构和/或活性与一个控制样本相比较。
15.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于适时检测了一个或多个ALK突变中的一个第一位置及其后的至少一个位置。
16.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的样本包括生殖细胞系或体细胞基因组DNA。
17.一种治疗一个患有癌症或具有罹患癌症风险的对象的方法，其特征在于包括: a.从对象身上采集一个样本；且 b.分析这个样本，检测是否有表1所列的一个或多个突变ALK多核苷酸分子， c.给所述的对象使用一个治疗有效量的一种ALK抑制剂。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于所述的ALK抑制剂包括PF-02341066，TOD，2-甲基-11-(2-甲基丙基)-4-氧-4，5,6, 11，12，13-六氢-2H-吲唑[5，4-α ]吡咯[3，4_c]咔唑-8-基[4- (二甲氨基)苄基]氨基甲酸甲酯，(13，25，31?，410-3-({5-氯-2-[(1-乙基-2，3，4，5-四氢-6-甲氧基-2-氧-1H-1-苯并氮杂卓_7_基)氨基]_4_嘧啶}氨基)双环[2.2.1]庚-5-烯-2-甲酰胺和NVP-TAE684。
19.如权利要 求17所述的方法，其特征在于所述的ALK抑制剂是PF-02341066。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于所述的患者事先没有使用一种ALK抑制剂进行治疗，或者事先已经使用了一种ALK抑制剂进行治疗，并对ALK抑制剂已经至少产生了一部分的抗性。
21.一种用于确定一个癌症患者的化学敏感性，从而对其使用一种ALK抑制剂进行治疗的试剂盒，其特征在于包括:一种与一个或多个突变ALK多核苷酸分子或多肽形成特定结合的试剂；和使用说明书。
22.如权利要求21所述的试剂盒，其特征在于还包括一种ALK抑制剂。
23.如权利要求21所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂包括一个或多个核酸探针，其中每一个探针包括一个多核苷酸序列，这个多核苷酸序列与表1所列的其中一个核苷酸序列互补，或者与一个编码表1所列的其中一个多肽的核苷酸序列互补。
24.如权利要求23所述的试剂盒，其特征在于所述的探针包括长度为50-107个核苷酸的多核苷酸。
25.如权利要求23所述的试剂盒，其特征在于所述的探针包括寡核苷酸，cRNA分子，RNA分子和由碱基组成的合成基因探针。
26.如权利要求21所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂包括一种抗体，一种抗体衍生物和一种抗体片段到一种多肽，其是由表1所列的一个或多个多核苷酸序列编码而成。
27.一种确定一种检测化合物是否调节了一个或多个突变ALK多肽的活性的方法，其特征在于包括 (a)与哺乳动物细胞接触，使其转染一个结构，并用检测化合物来编码一个或多个突变的ALK多肽；并 (b)测定该哺乳动物细胞来确定一个或多个突变ALK多肽的活性，其中由于检测化合物在一个控制表达中显著地调节了活性，因此它可以作为一个或多个突变ALK多肽的调节器。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于所述的一个或多个突变的ALK多核苷酸分子或多肽包括表1所列的突变ALK多核苷酸分子或多肽。
29.如权利要求27或28所述的方法，其特征在于所述的控制包括哺乳动物细胞表达如表1所列的多肽中的一个野生型ALK多肽。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于所述的一个或多个突变ALK多肽的活性包括ATP结合，酪氨酸激酶活性，癌症细胞增殖，肿瘤生长，肿瘤数量，细胞凋亡和肿瘤转移。
31.如权利要求27或28所述的方法，其特征在于所述的控制表达包括哺乳动物细胞在所述的检测化合物中表达一个或多个突变ALK多肽。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于所述的一个或多个突变ALK多肽包括ATP结合，酪氨酸激酶活性，癌症细胞增殖，肿瘤生长，肿瘤数量，细胞凋亡和肿瘤转移。
【文档编号】G01N33/68GK103937877SQ201410061691
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2011年2月4日 优先权日:2010年2月4日
【发明者】马诺·真田广之, 崔英李, 苏达学 申请人:自治医科大学