一种卷烟滤嘴水浸提液体外微核试验阳性对照设置方法
【专利摘要】本发明一种卷烟滤嘴水浸提液体外微核试验阳性对照设置方法，该方法为：1）选取相同数量的符合制备阳性对照条件的卷烟滤嘴和待测样品组卷烟滤嘴；2）配制浓度为200-400μg/ml的环磷酰胺水溶液；3）在用于制备阳性对照组的卷烟滤嘴上均匀喷洒环磷酰胺水溶液，待其自然干燥后备用；4）用相同的方法对阳性对照组和待测样品组卷烟滤嘴进行浸提；5）浸提液作为溶剂，用粉末细胞培养基进行配制，将配制后的溶液过滤除菌；6）对经步骤5）处理的提取液进行体外微核试验。通过该方法设置的阳性对照，可以验证卷烟滤嘴的提取过程和后续对卷烟滤嘴水浸提液进行的体外微核试验是否可靠。
【专利说明】一种卷烟滤嘴水浸提液体外微核试验阳性对照设置方法
【技术领域】
[0001]本发明属于烟草【技术领域】，具体涉及一种对卷烟滤嘴水浸提液进行体外微核试验时的阳性对照设置方法。
【背景技术】
[0002]微核试验是检测染色体或有丝分裂器损伤的一种遗传毒性试验方法。无着丝粒的染色体片段或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期仍留在子细胞的胞质内成为微核。体外微核试验一般是利用体外培养的动物细胞来进行微核的检测。它常常作为食品、药品、牙科材料等的安全性生物学检测手段之一。
[0003]由于卷烟滤嘴和人口腔直接接触，存在潜在的健康风险，因此，有必要采用体外微核试验手段，对其可能存在的潜在危害进行考察。对卷烟滤嘴进行体外微核试验时，首先需要对卷烟滤嘴进行提取，然后再对提取液进行检测。因此，试验过程中需要设置阳性对照，以验证提取过程和后续的体外微核试验是否可靠。
[0004]现有的体外微核试验阳性对照设置方法有两类:第一种方法，如果受试物可以配制成溶液，则使用一定浓度的已知具有遗传毒性的试剂直接加到细胞培养液中制成阳性对照；第二种方法，如果受试物需要制备浸提液进行测试，则阳性对照最好为和受试物性质相同和相近的具有遗传毒性的材料，并且该材料使用和受试物相同的方法进行提取后，其浸提液应在试验中呈明显的阳性反应。
[0005]然而现有方法并不适用于卷烟滤嘴浸提液的体外微核试验，这是因为对卷烟滤嘴进行体外微核试验需要制备卷烟滤嘴浸提液，因此，使用上述第一种方法设置阳性对照则无法验证提取的过程是否可靠。而对于使用第二种方法，由于目前现有的卷烟滤嘴品种未发现具有遗传毒性，并且没有与卷烟滤嘴性质相近的具遗传毒性的材料，因此为验证卷烟滤嘴的提取过程和后续对卷烟滤嘴水浸提液进行的体外微核试验是否可靠，有必要开发一种针对卷烟滤嘴水浸提液体外微核试验的阳性对照设置方法。
[0006]经文献搜索，未发现与本
【发明内容】
相同文献的公开报道。
[0007]
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种对卷烟滤嘴水浸提液进行体外微核试验时的阳性对照设置方法。通过该方法设置的阳性对照，可以验证卷烟滤嘴的提取过程和后续对卷烟滤嘴水浸提液进行的体外微核试验是否可靠。
[0009]卷烟抽吸时滤嘴与人的口腔接触，对卷烟滤嘴进行提取需要选用和人唾液性质相接近的溶剂(水或人工唾液)，因此人为添加到滤嘴上的阳性物也是水溶性的。本发明使用环磷酰胺作为人为添加的遗传毒性物质。环磷酰胺的CAS号为50-18-0，是一种水溶性染色体断裂剂，是体外微核试验中常用的一种阳性对照试剂。因此，通过将环磷酰胺添加到滤嘴上作为阳性对照样品，然后和待测样品一起制备水浸提液进行体外微核试验，如果阳性对照呈阳性结果，则说明卷烟滤嘴的提取过程和后续对卷烟滤嘴水浸提液进行的体外微核试验是可靠的。
[0010]本发明可通过下述技术方案来实现:
选取相同数量的符合制备阳性对照条件的卷烟滤嘴(作为后续用于制备阳性对照组的卷烟滤嘴)和待测样品组卷烟滤嘴；
步骤(2)配制浓度为200-400 μ g/ml的环磷酰胺水溶液；
步骤(3)在用于制备阳性对照组的卷烟滤嘴上均匀喷洒步骤(2)配制的环磷酰胺水溶液，喷洒量应使环磷酰胺在滤嘴浸提试验测试体系中的理论完全溶出终浓度大于等于20μ g/ml，并使卷烟滤嘴充分吸收环磷酰胺溶液，待其自然干燥后作为阳性对照组卷烟滤嘴备用;
步骤(4)用相同的方法对相同数量的步骤(3)制备的阳性对照组卷烟滤嘴和待测样品组卷烟滤嘴进行浸提；
步骤(5)使用步骤(4)得到的浸提液作为溶剂，用粉末细胞培养基按照培养基说明的方法进行配制，然后将配制后的溶液过滤除菌后用于后续的体外微核试验；
步骤(6)对经步骤(5)处理过的提取液进行体外微核试验，测试提取液在测试体系中的浓度为100%、50%、25%和12.5% 4个剂量(低浓度的测试液使用细胞培养液稀释得到)，提取液的细胞暴露时间为24小时。
[0011]所述步骤(I)中的符合制备阳性对照条件的卷烟滤嘴是指:(I)用于制备阳性对照的卷烟滤嘴不会因与环磷酰胺发生较强化学反应而影响其阳性结果；(2)用于制备阳性对照的卷烟滤嘴不会因与环磷酰胺产生较强吸附作用而影响其阳性结果；(3)用于制备阳性对照的卷烟滤嘴水浸提液原液在细胞毒性试验中测出的细胞存活率应大于等于50%。
[0012]步骤(3)中所述的理论完全溶出浓度是指:根据所配制的环磷酰胺溶液实际浓度、环磷酰胺的实际喷洒量和提取时实际所加的溶剂量，在假定喷洒在滤嘴上的环磷酰胺在浸提时可以100%溶出的条件下计算得到的浓度。
[0013]本发明与现有技术相比，其有益效果为:本发明的卷烟滤嘴水浸提液体外微核试验阳性对照设置方法操作简单易行，经济实用。本发明使用的人为添加的阳性物环磷酰胺，是一种水溶性染色体断裂剂，易于溶解在滤嘴的提取溶剂蒸馏水中。本发明所设置的环磷酰胺水溶液的浓度和测试剂量可使得体外微核试验呈阳性结果，并且呈现出较好的剂量效应关系。通过该方法设置的阳性对照，可以验证卷烟滤嘴的提取过程和后续对卷烟滤嘴水浸提液进行的体外微核试验是否可靠。
[0014]
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是以本发明的方法制备人为阳性滤嘴作为阳性对照，对2种随机挑选的市售卷烟滤嘴的水浸提液进行体外微核试验所得到的不同浓度的浸提液的微核率图。
【具体实施方式】
[0016]下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但本发明的内容并不局限于此。
[0017]实施例1 以本发明的方法制备人为阳性滤嘴作为阳性对照，对2种随机挑选的市售卷烟滤嘴进行体外微核试验。
[0018]1、随机挑选2种市售卷烟，每种随机抽取20支用于制备待测样品组卷烟滤嘴。随机抽取20支符合制备阳性卷烟滤嘴条件的肯塔基3R4F卷烟用于制备阳性对照组的卷烟滤嘴。将上述卷烟滤嘴切割下来备用，切割时应避免切到接装纸和卷烟纸的交叠部分，以防止将卷烟纸和烟丝带入滤嘴样品中。
[0019]2、配制浓度为200 μ g/ml的环磷酰胺水溶液。
[0020]3、在用于制备阳性对照的3R4F卷烟滤嘴上均匀喷洒步骤2中配制的环磷酰胺水溶液10mL，使环磷酰胺在卷烟滤嘴浸提试验测试体系中的理论完全溶出终浓度为20 yg/ml (提取时加水量为lOOmL)，使卷烟滤嘴充分吸收添加的环磷酰胺溶液，待卷烟滤嘴自然干燥后作为阳性卷烟滤嘴对照组备用。
[0021]4、用10mL蒸馏水对步骤3制备好的阳性对照组卷烟滤嘴和2种待测样品组卷烟滤嘴(样品I和样品2)在40 C下静直提取30min。
[0022]5、用步骤4得到的水浸提液作为溶剂，用DMEM粉末细胞培养基按照培养基说明的方法进行配制，并加入胎牛血清，使得胎牛血清体所占体积比为提取液总体积的10%，然后将配制后的溶液过滤除菌，后用于后续的体外微核试验。
[0023]6、对经步骤5处理过的提取液使用CHO细胞进行体外微核试验，测试提取液在测试体系中的浓度为100%、50%、25%和12.5% 4个剂量(低浓度的测试液使用细胞培养液稀释得到)。在细胞培养液中加入细胞松弛素B，使其浓度为3 μ g/mL。暴露24小时之后收获细胞，经低渗和固定处理后用滴片法制作微核玻片。微核玻片经Giemsa染色后在显微镜下对1000个双核细胞进行微核计数。
[0024]7、各样品不同浓度下的微核率见图1。由试验结果可见，所测试的2种滤嘴样品的提取液在4个受试浓度下均未表现出明显的剂量反应关系，且微核率和空白对照组无显著差异性(/7>0.05)，因此为阴性结果。人为阳性滤嘴样品提取液的微核率随测试浓度的增高而降低，具有较为明显的剂量反应关系，并且100%、50%和25%三个剂量的微核率与空白对照组比较都具有显著性差异ΟΚΟ.05)，因此为阳性结果。说明本实施例中卷烟滤嘴的提取过程和后续对卷烟滤嘴水浸提液进行的体外微核试验是可靠的。
[0025]环磷酰胺水溶液的配制浓度还可以为250 μ g/ml >300 μ g/ml>350 μ g/ml >400μ g/ml 等。
[0026]以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
【权利要求】
1.一种卷烟滤嘴水浸提液体外微核试验阳性对照设置方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: 步骤(I)选取相同数量的符合制备阳性对照条件的卷烟滤嘴和待测样品组卷烟滤嘴； 步骤(2)配制浓度为200-400 μ g/ml的环磷酰胺水溶液； 步骤(3)在用于制备阳性对照组的卷烟滤嘴上均匀喷洒步骤(2)配制的环磷酰胺水溶液，喷洒量应使环磷酰胺在滤嘴浸提试验测试体系中的理论完全溶出浓度大于等于20μ g/ml，并使卷烟滤嘴充分吸收环磷酰胺溶液，待其自然干燥后作为阳性对照组卷烟滤嘴备用; 步骤(4)用相同的方法对步骤(3)制备的阳性对照组卷烟滤嘴和待测样品组卷烟滤嘴进行浸提； 步骤(5)使用步骤(4)得到的水浸提液作为溶剂，用粉末细胞培养基按照培养基说明的方法进行配制，然后将配制后的溶液过滤除菌后用于后续的体外微核试验； 步骤(6)用步骤(5)处理过的提取液进行体外微核试验，测试提取液在测试体系中的浓度为100%、50%、25%和12.5% 4个剂量，提取液的细胞暴露时间为24小时。
2.根据权利要求1所述的卷烟滤嘴水浸提液体外微核试验阳性对照设置方法，其特征在于:步骤(4)所述的卷烟滤嘴的浸提采用蒸馏水作为提取液。
【文档编号】G01N33/50GK104237495SQ201410489543
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月23日 优先权日:2014年9月23日
【发明者】夭建华, 朱洲海, 曾婉俐, 高茜, 米其利, 黄海涛, 管莹, 李雪梅, 徐济仓, 唐萍 申请人:云南中烟工业有限责任公司