一种膜蛋白固相富集耦合质谱检测的系统及方法与流程

本发明属于生化分析技术领域，涉及固相富集膜蛋白的方法及膜蛋白的质谱检测分析。

背景技术：

膜蛋白在细胞活动中承担了各种各样的重要生物学功能，包括分子运输和信号转导等，影响蛋白质的分泌和稳定性，免疫及炎症反应以及影响蛋白质在细胞内的转送方向等。更重要的是，有些膜蛋白通常被认为是重要的生物标志物，因此它们的检测往往和相关病理或生理过程有着非常紧密的联系。例如，分化抗原蛋白是分布极为广泛的细胞表面跨膜蛋白，主要参与异质性粘附，即肿瘤细胞与宿主细胞和宿主基质的粘附，异质性粘附在肿瘤细胞侵袭转移中起促进作用。目前，分化抗原的表达可作为临床预测淋巴结转移和估计预后的重要指标。然而，膜蛋白的研究还面临以下两方面困难。首先，由于大多数膜蛋白具有疏水性的特征，而膜蛋白的疏水特性使其需要与生物膜共同形成稳定的自然构象，所以在纯化时很难选择合适的溶解试剂。其次，用传统的方法，如抗原抗体免疫反应和蛋白质印记法，只能单独研究很少量的蛋白，而且对于低丰度的膜蛋白的检测更是困难的。截至目前，蛋白质数据库(Protein Data Bank)中仅仅有1％左右的结构数据是属于膜蛋白的。因此，一种高通量、高灵敏、高选择的膜蛋白检测系统和方法亟待开发。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种步骤简单、操作方便、快速高效、能实现固相富集膜蛋白并联用质谱检测的系统及检测方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种膜蛋白固相富集耦合质谱检测的系统，包括疏水性多孔酶反应器及质谱仪；所述疏水性多孔酶反应器采用疏水基团修饰的多孔氧化硅材料为吸附剂，对膜蛋白进行选择性富集和快速原位酶解，酶解产物由所述质谱仪进行质谱分析。

进一步地，所述多孔氧化硅材料采用亚甲基修饰。氧化硅为SiO₂。

进一步地，经疏水基团修饰的所述多孔氧化硅材料的孔径小于等于10μm，优选为100nm左右。

进一步地，经疏水基团修饰的所述多孔氧化硅材料的水滴接触角大于等于20度。

进一步地，所述质谱仪包括电喷雾型质谱仪或激光解析电离型质谱仪。

一种膜蛋白固相富集耦合质谱检测的方法，包括以下步骤：

步骤1：合成疏水基团修饰的多孔氧化硅材料；

步骤2：在生物样品中，加入步骤1中经疏水基团修饰的多孔氧化硅材料；

步骤3：收集下层固体相，即所述经疏水基团修饰的多孔氧化硅材料；

步骤4：清洗步骤3中收集到的所述下层固体相，加入蛋白酶进行酶解；

步骤5：进行质谱分析。

进一步地，所述步骤1中采用后嫁接法合成亚甲基修饰的多孔氧化硅材料。

进一步地，所述步骤2中所述生物样品的浓度为0.001mg/mL～100mg/mL，体积小于100mL。

进一步地，所述步骤4中酶解溶液的pH值范围为4～11，温度范围为20～50℃。

进一步地，所述步骤4中的蛋白酶为胰蛋白酶。

本发明利用多孔氧化硅材料的孔容限定作用以及疏水性材料表面与疏水性膜蛋白的结合作用，实现疏水性膜蛋白在材料上的选择性富集，对富集有膜蛋白的氧化硅纳米材料进行原位酶解，分别收集富集有疏水性多肽的氧化硅纳米材料和上清溶液，对富集有疏水性多肽的氧化硅纳米材料进行洗脱，洗脱液和上清溶液混合后进行质谱检测，可实现对膜蛋白快速便捷的高灵敏分析。本发明选用的功能化的多孔氧化硅材料具有巨大的比表面积，可以在富集的同时完成快速原位酶解，免去传统酶解耗时长等缺点。利用多孔材料的预处理富集有利于低丰度膜蛋白的检测，而质谱技术又提供高通量分析膜蛋白的方法。疏水性的多孔氧化硅材料固相富集膜蛋白与质谱联用系统可以实现对膜蛋白快速、高效、灵敏、选择性的检测。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

图1是本发明膜蛋白固相富集耦合质谱检测的流程图；

图2是本发明较优实施例中得到的材料的扫描电子显微镜图片和透射电子显微镜图片，图2a是透射电子显微镜图片，图2b是扫描电子显微镜图片；

图3是标准细菌视紫红质蛋白酶解肽段的基质辅助激光解吸电离质谱图(MALDI-MS)谱图，纵坐标为质谱峰的相对强度，横坐标为质荷比(m/z)；图3a为富集前，图3b为富集后；为细菌视紫红质蛋白的特征峰，酶解后的肽段。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行进一步描述。

亚甲基修饰的多孔氧化硅纳米材料可按下述步骤以有机硅为修饰剂通过后嫁接法合成：

将1.0～1.3克聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物和1.7～2.0克无水硫酸钠溶解在25～35克pH为5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，在室温下机械搅拌12～24小时，再加入1.5～1.6克四甲氧基硅烷并搅拌12～24小时，然后置于不锈钢高压反应釜中，将反应釜置于100～130摄氏度的烘箱中12～24小时，取出，用去离子水洗涤除去未反应的反应物，最后将产物真空干燥并保存，最后加入1.0～4.0克1,2-二(三乙氧基甲硅烷基)乙烷反应24小时，收集备用。

配制2mg/mL的疏水性的多孔氧化硅材料，超声震荡10分钟，在铜网和铝箔上制样，电子显微镜图像采用JEOL2011显微镜。扫描电子显微镜图像采用JEOL飞利浦XL30显微镜。其扫描电子显微镜图片和透射电子显微镜图片如图2所示。

在较优的实施例中，多孔氧化硅纳米材料的孔径为50～100nm，选用疏水修饰的多孔氧化硅材料，与细胞裂解液在25～37摄氏度下混合20～30分钟，以使样品中的膜蛋白充分吸附；细胞裂解液浓度为0.1mg/mL～1mg/mL,体积为～1mL；所述的细胞裂解液溶于0.2％氯化铵的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中。

本发明中，对于步骤(3)中得到的下层固体相，用25mM,pH～8.0的碳酸氢铵缓冲液清洗材料1～3次，去除材料上非特异性吸附的蛋白质，再把材料重新溶于100mM,pH～8.0的缓冲液中，然后加40mg/mL胰蛋白酶溶液在纳米材料孔中原位快速酶解。收集在上清中的酶解产物，进行质谱分析。

实施例1：亚甲基修饰的大孔氧化硅纳米材料对细菌视紫红质蛋白富集能力的试验。

配制100ng/uL级别标准细菌视紫红质蛋白溶液(溶于乙腈水溶液中)，将材料在该溶液中孵育15～30分钟，在离心作用下将材料从溶液中分离出来。弃除上清液，加入胰蛋白酶快速原位酶解，所得酶解产物与基质分子复合干燥结晶后进行质谱分析，可有效鉴定分析该蛋白，结果如图3所示。对比图3a和图3b可以看出，细菌视紫红质蛋白的肽段能够被选择性地富集。

实施例2：亚甲基修饰的多孔氧化硅纳米材料对细胞裂解液中膜蛋白富集能力的试验。

配制细胞裂解液(溶于乙腈水溶液中)，将材料在该溶液中孵育15～30分钟，在离心作用下将材料从溶液中分离出来。弃除上清液，加入胰蛋白酶快速原位酶解。冷冻旋干酶解产物后，加入三氟乙酸的乙腈水溶液，进入电喷雾型质谱进行分析，可一次性分析检测数百种蛋白，部分膜蛋白如表1所示。

表1为细胞裂解液中膜蛋白的富集实验后检测到的部分膜蛋白。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。