一种分离和测定阿利维A酸与异构体的方法与流程

本发明属于分析化学领域，涉及一种分离阿利维A酸及异构体的方法；本方法还涉及测定化妆品中添加的维A酸类及其异构体或相同结构物质的方法。

背景技术：
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阿利维A酸是一种内源性维甲酸，现用于局部外用强效糖皮质激素无效的慢性手部湿疹患者，也用于治疗皮肤卡波济肉瘤。

阿利维A酸很容易与维A酸等其他异构体发生异构化而互相转换，在合成和放置过程中均可能转化为其他异构体：

现有文献主要是维A酸、异维A酸的测定方法，但其维A酸与阿利维A酸的分离度达不到1.5，且阿利维A酸的保留时间达到30min以上，对分析效果和效率都不能满足要求。本发明人对比维A酸、异维A酸后，发现现有技术中有关异维A酸的有关物质测定方法均不能很好分离阿利维A酸与维A酸。见如下：

表1现有技术异维A酸测定方法

目前，维A酸类化合物不仅被应用于多种皮肤疾病以及癌症预防和治疗，也屡有发生不良企业或商家在化妆品中添加维A酸类药物的情况。因此，研究将阿利维A酸与其异构体分离，并进行定量检测的方法很有现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能够用于阿利维A酸及其5种异构体的有效分离和测定的高效液相色谱方法，并提高分离检测的效率。

本发明的技术方案为：

一种高效液相色谱法分离测定阿利维A酸及其5种异构体的方法，为反相液相色谱法,色谱柱填料为十八烷基或八烷基键合硅胶，用含甲醇和酸的混合液的流动相洗脱后采用紫外检测器进行检测，其特征是：流动相中还含有叔丁基甲醚，含量占流动相总体积的15％-35％。

所述含甲醇和酸的混合液的体积比是：酸:水:甲醇＝0.2～2:30～70:70～30；

所述酸选自磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸中的一种或多种，优选为乙酸。

优选十八烷基键合硅胶颗粒粒径为3.5μm，柱长优选为250mm。

其它分析条件：

色谱柱适用的柱温范围为20-40℃，优选为30℃。

流动相的流速为0.2-2.0ml/min，优选为0.5-1.5ml/min，更优选为1.0ml/min。

紫外检测器的检测波长为350nm，检测器型号不限，如可使用DAD或VWD检测器。

本发明一个具体实施方式中，色谱柱为十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱(Thermo Hypersil 250×4.6mm,5μm)。叔丁基甲醚：甲醇：1％冰乙酸＝15：60：25(v/v/v)；

操作方法为：取阿利维A酸、异构体1、异构体2、异构体3、异构体4、异构体5对照品各适量，用甲醇溶解，配制成每1ml含阿利维A酸200μg、异构体1、异构体2、异构体3、异构体4、异构体5各2μg的系统适用性溶液。

注入液相色谱仪，按本发明色谱条件(色谱柱填料为十八烷基键合硅胶，柱长为250mm，检测波长为350nm，以叔丁基甲醚：甲醇：1％冰乙酸＝15：60：25(v/v/v))进行洗脱，流动相的流速为1.0ml/min，色谱柱柱温箱温度为30℃，进样体积为20μl进行测定。

本发明方法适用于阿利维A酸及5种异构体的分离和测定，可用于单独检测某一种异构体，也可同时分离和检测这5种异构体。可用于阿利维A酸原料药及阿利维A酸软胶囊、阿利维A酸乳膏、阿利维A酸凝胶、各种化妆品中阿利维A酸及其异构体的检测和质量控制，还可用于检测服用阿利维A酸者体内的生物代谢物。

实例1图1中的阿利维A酸与维A酸分离达到2.67，阿利维A酸理论塔板数12067，阿利维A酸保留时间为8.831min，保留时间8.831min的峰纯度为0.999,保留时间8.831min的峰对称因子为1.02；而对比例例1图2中阿利维A酸与维A酸分离明显无法分开，理论塔板数5678，阿利维A酸保留时间为39.856min，保留时间为39.856min的峰纯度为0.825，保留时间8.831min的峰对称因子为1.38；通过对比实例1与对比例1，得出本发明的有以下有益处效果。

本发明的有益效果在于：

1、阿利维A酸与异构体分离较好，专属性强。

现有技术方法，对比例1中，其他异构体之间都能很好分离，但阿利维A酸与维A酸分离度达不到分离要求，本发明的方法实施例1中，不但其他异构体之间都能很好分离，而且阿利维A酸与维A酸分离达到2.67；现有技术方法对比例1中，阿利维A酸的理论塔板数5678，本发明的方法实施例1中，阿利维A酸的理论塔板数为12067；现有技术方法对比例1中，阿利维A酸峰的的峰对称因子为1.38，峰纯度为0.825；本发明的方法实施例1中，阿利维A酸峰的的峰对称因子为1.02，峰纯度为0.999。对比例和实施例，各异构体出峰顺序一致，现有技术不能对阿利维A酸与维A酸分离，而本发明方法能将阿利维A酸与维A酸完全分开，在进行分离阿利维A酸与维A酸时专属性更强。

2、用时短，提高了效率。

现有技术方法，对比例1中，各异构体均比本发明的实施例的保留强，阿利维A酸和维A酸保留时间为39.856min，本发明实施例1中的方法阿利维A酸和维A酸保留时间分别为8.831min为9.995min；本发明比现有技术的分离效率高。

3、结果更准确。

本发明由于分离的专属性更高后，进行含量测定时，就不会将阿利维A酸和维A酸一起作为阿利维A酸或维A酸的进行含量和有关物质的计算，故比现有技术方法更准确。

注：以上所述现有技术，指“EP7.5版异维A酸原料药质量标准”中有关测定异维A酸及其制剂的标准方法。并将色谱柱的原色谱柱柱长150mm换为分离更好的长色谱柱250mm。

表2本发明方法与现有技术方法对比

注：

各对比例采用现有技术方法测定，具体指“EP7.5版异维A酸原料药质量标准”中规定的方法，并将标准规定的原色谱柱柱长150mm换为分离更好的长色谱柱250mm。

各实施例采用本发明的方法检测。

附图说明

图1为采用本发明的方法检测阿利维A酸混合异构体的色谱图，各峰从左至右，依次为：异构体4、异构体5、异构体2、异构体3、阿利维A酸、异构体1；

图2为采用EP7.5异维A酸方法测定阿利维A酸混合异构体的色谱图，各峰从左至右，依次为：异构体4、异构体5、异构体2、异构体3、阿利维A酸。(可看出阿利维A酸和异构体1未分开)；

图3为采用本发明的方法检测阿利维A酸光降解杂质的色谱图，各峰从左至右，依次为：异构体2、阿利维A酸、异构体1，未知杂质1、未知杂质2；

图4为采用EP7.5方法检测阿利维A酸光降解杂质的色谱图，各峰从左至右，依次为：异构体2、阿利维A酸、未知杂质1、未知杂质2。(可看出阿利维A酸和异构体1未分开)；

图5为采用本发明的方法检测阿利维A酸软胶囊的色谱图，各峰从左至右，依次为阿利维A酸、维A酸；

图6为采用本发明的方法检测阿利维A酸软胶囊的色谱图2，各峰从左至右，依次为阿利维A酸、维A酸。

图7为采用本发明的方法检测阿利维A酸软胶囊生物代谢的色谱图，各峰从左至右，依次为阿维A、阿利维A酸、维A酸。

具体实施方式

以下所举实施例是为了更清楚地对本发明的内容进行说明，但本发明的内容并不仅限于实施例中所举。所以，熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

除特别说明，以下实施例和对比例采用的仪器及色谱柱等条件如下：

日本岛津SHIMADZU LC-20AT液相色谱仪，检测器：UV；色谱工作站：LCsolution， 色谱柱：十八烷基键合硅胶或八烷基键合硅胶，流速：1.0ml/min；色谱柱柱温箱温度为30℃。

实施例1 本发明方法检测阿利维A酸6种混合异构体

取阿利维A酸、异构体1、异构体2、异构体3、异构体4、异构体5标准品共同溶解于甲醇，配制成每1ml含阿利维A酸、异构体1、异构体2、异构体3、异构体4、异构体5各2μg的系统适用性溶液。

取20μl注入液相色谱仪；

色谱条件：色谱柱：ODS柱(Thermo Hypersil 250mm×4.6mm，3.5μm)，检测波长为350nm，以叔丁基甲醚：甲醇：1％乙酸＝15：60：25(v/v/v)进行洗脱，记录色谱图。

得图1为采用本发明的方法检测阿利维A酸6种混合异构体的色谱图。

对比例1 EP7.5异维A酸方法测定阿利维A酸6种混合异构体

采用的仪器及色谱柱和系统适用性溶液同实施例1。

取实施例1的待测样品溶液20μl注入液相色谱仪，按EP7.5异维A酸的色谱方法，以甲醇-水-冰乙酸(770:225:5)进行洗脱，记录色谱图。

得图2为采用EP7.5异维A酸方法测定阿利维A酸混合异构体的色谱图。

实施例2 本发明方法检测阿利维A酸光降解杂质

由于维A酸类药物，光降解溶液异构化，故将阿利维A酸进行光强制降解后得到的光降解物质进行测定。

将阿利维A酸原料药，在照度5000XL条件下10小时样品，用甲醇稀释成600μg的样品溶液，取10μl注入液相色谱仪；

色谱条件：色谱柱：ODS柱(Thermo Hypersil 250mm×4.6mm，3.5μm)，检测波长为355nm，以叔丁基甲醚：甲醇：2％甲酸＝25：45：30(v/v/v)进行洗脱，记录色谱图。

得图3采用本发明的方法检测阿利维A酸光降解杂质的色谱图。

对比例2 EP7.5方法检测阿利维A酸光降解杂质

取实施例2的待测样品溶液20μl注入液相色谱仪；

色谱柱：ODS柱(Thermo Hypersil 250mm×4.6mm，3.5μm)，检测波长为355nm，进样量为10μl；流速：1.5ml/min，按EP7.5异维A酸的色谱方法，以甲醇-水-冰乙酸 (770:225:5)进行洗脱，记录色谱图。

得图4采用EP7.5方法检测阿利维A酸光降解杂质的色谱图。

实施例3 本发明方法检测阿利维A酸软胶囊(一)

取阿利维A酸软胶囊，剪开，用10ml二氯甲烷将内容物溶解，然后加入甲醇混匀定容至100ml，过滤，即得约含阿利维A酸约100ug/ml的供试液；取供试液10μl；

色谱条件：八烷基键合硅胶色谱柱(Boston Green C84.6mm×250mm，5μm)，检测波长为350nm，以叔丁基甲醚：甲醇：0.5％乙酸＝35：30：35(v/v/v)进行洗脱，记录色谱图。

得色谱图为图5。

实施例4 本发明方法检测阿利维A酸软胶囊(二)

除流动相不同，其余与实施例3实验内容完全相同。

流动相是：叔丁基甲醚：甲醇：0.3％磷酸＝20：40：40(v/v/v)。

得色谱图为图6。

实施例5 本发明方法检测阿利维A酸软胶囊生物代谢物

内标工作液：取适量阿维A，用甲醇稀释得40μg/ml的内标工作液。

取服用了阿利维A酸软胶囊的血0.5ml，加入4.0ug/mL内标阿维A酸溶液50μL，涡旋震荡30s混匀，加乙醚5mL，涡旋震荡3min，4000rpm离心5min，转移上层有机相于另一尖底试管，置40℃水浴中通氮气流挥干。残留物溶于100μl甲醇：DMF(1:1v/v)，振荡30s，13000rpm离心3min，取上清液进样40μl；

以叔丁基甲醚：甲醇：2％三氟乙酸＝23：47：30(v/v/v)进行洗脱，记录色谱图。

得色谱图为图7。