一种藏药螃蟹甲的检测方法与流程

本发明涉及一种藏药螃蟹甲的检测方法，属于医药技术领域。

背景技术：

螃蟹甲为藏医习用药材，来源于唇形科糙苏属多年生草本植物螃蟹甲Phlomis younghusbandii Mukerjee的干燥块根，藏语称“露木尔”，至今已有千余年的使用历史。螃蟹甲有清热疏风，润喉散寒，生肌敛疮，止咳化痰的作用，多用于治疗风湿感冒，咳嗽痰多，咽喉疫病，支气管炎，肺病等。

螃蟹甲药材被收载于卫生部颁布藏药第一册的《药品标准》中，标准号：WS3﹣BC﹣0124﹣95，仅性状项，无其他鉴别、检查及含量测定项，质量标准亟需提高。含有螃蟹甲的中成药有“七味螃蟹甲丸”、“催汤丸”，分别执行《药品标准》(藏药第一册，1995年版)和《中国药典》(2010年版一部)，对螃蟹甲仅有鉴别项，且其鉴别分离效果并不理想，不能全面反映螃蟹甲药材的质量。近几年对于螃蟹甲的研究较多，如《藏药催汤丸的薄层色谱研究》采用乙醇提取后氯仿-甲醇(6：4)展开，但其操作复杂，展开效果不理想，并且氯仿为易制毒管制，使用不便；《藏药螃蟹甲HPLC特征图谱研究》以乙腈-水梯度洗脱，乙腈浓度变化为在第0-8-10-20-40-60-70分钟，乙腈百分比浓度依次变为0-0-5-5-12.5-100-100，取用14个特征峰，但其梯度复杂，色谱图的分离效果不太理想，联峰、肩峰较多，实际重复该试验无法得到满意的图谱(见附图8)。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种藏药螃蟹甲的检测方法。

发明概述

本发明提供了一种藏药螃蟹甲药材的检测方法，包括鉴别方法和/或HPLC特征图谱检测方法，能全面地反映螃蟹甲中所含化学成分的种类与数量，进而对药材质量进行整体描述和评价。

本发明的技术方案如下：

一种藏药螃蟹甲的检测方法，包括如下鉴别和/或特征图谱方法：

A、薄层鉴别方法

取螃蟹甲药材粉末0.5﹣2g，加乙醇5-20ml，加热回流20-40分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；按照以上供试品溶液制备相同的方法制得对照药材溶液；取上述两种溶液各5 ﹣10μl点于同一硅胶GF254薄层板上，照薄层色谱法试验，以体积比4-8:1:0.2的异丙醇﹣甲醇-甲酸为展开剂展开，取出后晾干；采用M法和/或N法显色后，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；所述的M法为：置254nm紫外光灯下检视；N法为：喷以体积比10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；

B、HPLC特征图谱检测方法

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈﹣体积分数比为0.05％的磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱：乙腈体积百分变化为，0﹣15分钟保持4％，15﹣60分钟由12％升至40％，检测波长为245nm；流速：0.8﹣1.2ml/min；分析时间60分钟；

对照品溶液的制备：取山栀苷甲酯对照品适量，加甲醇制成每1ml含山栀苷甲酯0.2mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取藏药螃蟹甲粉末0.5﹣2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5﹣10μl，注入高效液相色谱仪，记录60分钟内的色谱图，即得螃蟹甲的HPLC特征图谱；

所得螃蟹甲HPLC特征图谱中的特征峰为13个，其中6号峰山栀苷甲酯为标准峰，13个峰与标准峰的相对保留时间分别为0.133﹣0.147、0.363﹣0.401、0.752﹣0.831、0.817﹣0.903、0.854﹣0.944、1.000、1.090﹣1.205、1.132﹣1.251、1.267﹣1.401、1.307﹣1.438、1.365﹣1.509、1.393﹣1.540、1.522﹣1.683。

优选的，上述薄层鉴别方法为：

取螃蟹甲药材粉末1g，加乙醇10ml，加热回流30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；按照以上供试品溶液制备相同的方法制得对照药材溶液；取上述两种溶液各5μl点于同一硅胶GF254薄层板上，照薄层色谱法试验，以体积比6:1:0.2的异丙醇﹣甲醇﹣甲酸为展开剂展开，取出晾干，采用M法和/或N法显色后，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；所述的M法为：置254nm紫外光灯下检视；N法为：喷以体积比10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。

优选的，上述HPLC特征图谱检测方法为：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈﹣体积分数比为0.05％的磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱：乙腈体积百分变化为，0﹣15分钟保持4％，15﹣60分钟由12％升至40％；检测波长为245nm；流速：1.0ml/min；分析时间60分钟；

对照品溶液的制备：取山栀苷甲酯对照品适量，加甲醇制成每1ml含山栀苷甲酯0.2mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取藏药螃蟹甲粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录60分钟内的色谱图，即得螃蟹甲的HPLC特征图谱；

所得螃蟹甲HPLC特征图谱中的特征峰为13个，其中6号峰山栀苷甲酯为标准峰，13个峰与标准峰的相对保留时间分别为0.140、0.382、0.791、0.860、0.899、1.000、1.148、1.191、1.334、1.369、1.437、1.466、1.602。

本发明中所述的重量份与体积份的单位对应关系为g/ml或Kg/L。

有益效果

本发明提供了一种藏药材螃蟹甲的检测方法，以对螃蟹甲进行较全面的质量检测。本发明以一定比例的异丙醇﹣甲醇﹣甲酸为展开剂，选择254nm紫外检视和/或喷以硫酸乙醇加热显色方法，所得图谱斑点清楚，分离度较高；以乙腈﹣体积分数比为0.05％的磷酸水溶液为流动相，通过梯度洗脱，得到螃蟹甲的HPLC特征图谱，并确立13个特征峰，该方法操作简单，检测全面，所得特征峰分离度较好，峰形清晰。

附图说明

图1、图2为以三氯甲烷﹣甲醇(6:4)为展开剂所得TLC鉴别图谱；

图3、图4为以三氯甲烷﹣甲醇(9:1)为展开剂所得TLC鉴别图谱；

图5、图6为以异丙醇﹣甲醇﹣甲酸(6:1:0.2)为展开剂所得TLC鉴别图谱；

图7为流动相1所得HPLC图谱；

图8为流动相2所得HPLC图谱；

图9为流动相3所得HPLC图谱；

图10为螃蟹甲药材HPLC特征图谱；

图11为山栀苷甲酯标准峰图谱；

其中，图1、3、5为254nm紫外灯下检视图；图2、4、6为硫酸乙醇加热显色图；图1-6中，1为螃蟹甲对照药材点样点，2、3、4分别为螃蟹甲三个批次20150103、20150204、20150301的螃蟹甲样品点样点；图7-图11中，横坐标为时间，单位：分钟，纵坐标为电压，单位：毫伏特。

具体实施方式

下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1：薄层鉴别检测方法实验

分别取三个批次20150103、20150204、20150301螃蟹甲药材粉末1g，加乙醇10ml，加热回流30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；同法制得对照药材溶液。取上述两种溶液各5μl点于同一硅胶GF254薄层板上，照薄层色谱法试验，分别以文献方法，即三氯甲烷﹣甲醇(体积比6:4)、三氯甲烷﹣甲醇﹣水(体积比13:7:2)、石油醚(60﹣90℃)﹣乙酸乙酯﹣丙酮﹣甲酸(体积比15:15:10:1)、三氯甲烷﹣甲醇(9:1)、异丙醇﹣甲醇﹣甲酸(体积比4:1:0.2)、异丙醇﹣甲醇﹣甲酸(体积比6:1:0.2)、异丙醇﹣甲醇﹣甲酸(体积比8:1:0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。喷以体积比10％硫酸乙醇溶液显色，在105℃加热至斑点显色清晰。判定：在供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

结果分析：

展开剂为三氯甲烷﹣甲醇(体积比6:4)、三氯甲烷﹣甲醇﹣水(体积比13:7:2)、石油醚(60﹣90℃)﹣乙酸乙酯﹣丙酮﹣甲酸(体积比15:15:10:1)：Rf值较大，斑点集中在溶剂前沿位置，其中254nm紫外检视可见药材斑点长带，无法清晰分辨；硫酸乙醇加热显色后斑点有重叠，无法满足鉴别目的；展开剂为三氯甲烷﹣甲醇(体积比6:4)的TLC图谱见图1、图2；

展开剂为三氯甲烷﹣甲醇(体积比9:1)：展开斑点Rf值较小，斑点集中在点样位置，斑点未充分展开，重叠严重，无法达到鉴别目的；展开剂为三氯甲烷﹣甲醇(体积比9:1)的TLC图谱见图3、图4；

展开剂为异丙醇﹣甲醇﹣甲酸(体积比4:1:0.2)、异丙醇﹣甲醇﹣甲酸(体积比6:1:0.2)、异丙醇﹣甲醇﹣甲酸(体积比8:1:0.2)，药材斑点Rf值在0.4﹣0.7之间，且分离良好，显色清晰。展开剂为异丙醇﹣甲醇﹣甲酸(体积比4:1:0.2)的TLC图谱见图5、图6。

因此，在体积份数比为4﹣8:1:0.2的异丙醇﹣甲醇﹣甲酸展开剂条件下，有较好的展开效果。其中，体积份数比6:1:0.2的异丙醇﹣甲醇﹣甲酸的展开剂展开效果最好。

实验例2：标准特征图谱的获得实验

1、实验仪器及试剂

试验仪器：高效液相色谱仪：Agilent 1260

电子天平：岛津AUW﹣220D

紫外分光光度计：岛津UV﹣2450

对照品：山栀苷甲酯对照品(中国食品药品检定研究院)批号：111873﹣201103

供试品：螃蟹甲(金诃藏药股份有限公司提供)批号：20150101、20150103、20150204、20150205、20150301、20150302、20150303、20150401、20150402、20150403。

2、色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为245nm；流速：1.0ml/min；分析时间：60分钟。

对照品溶液的制备：取山栀苷甲酯对照品适量，加甲醇制成每1ml含山栀苷甲酯0.2mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取藏药螃蟹甲粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

检测波长选择：按供试品溶液的制备方法得到供试品溶液，190﹣600nm波长范围内进行扫描，根据紫外吸收图谱，选定245nm为检测波长。

流动相选择：按供试品溶液的制备方法得到供试品溶液，分别采用下列流动相进行实验：

流动相1：乙腈(A)﹣水(B)，梯度洗脱：0﹣8分钟乙腈保持8％，8﹣35分钟乙腈由8％升至35％，35﹣50分钟乙腈由35％升至75％，50﹣75分钟乙腈保持75％；

流动相2：乙腈(A)﹣水(B)，梯度洗脱：0﹣8分钟乙腈保持0％，8﹣10分钟乙腈由0％升至5％，10﹣20分钟乙腈保持5％，20﹣40分钟乙腈由5％升至12.5％，40﹣60分钟乙腈由12.5％升至100％，60﹣70分钟乙腈保持100％；

流动相3：乙腈(A)﹣体积分数比为0.05％的磷酸水溶液(B)，梯度洗脱：0﹣15分钟乙腈保持4％，15﹣60分钟乙腈由4％升至40％；

3、结果：见图7-9。

流动相1图谱：出峰较多但集中于前30分钟，重叠峰较多，分离度不理想；

流动相2图谱：出峰偏少，且60分钟后出峰重叠，分离度较差；

流动相3图谱：出峰较多，分离度较好。

4、HPLC特征图谱：取10批螃蟹甲按供试品溶液的制备方法得到供试品溶液，按上述色谱条件获得10批螃蟹甲制剂的高效液相色谱图，以这10批螃蟹甲制剂特征图谱为基础，采用《中药色谱特征图谱相似度评价系统2004A》进行评价，在245nm检测波长下的相似度大于0.85的图谱。如图10所示。

所得螃蟹甲HPLC特征图谱中的特征峰为13个，其中6号峰山栀苷甲酯为标准峰，13个峰与标准峰的相对保留时间分别为0.133﹣0.147、0.363﹣0.401、0.752﹣0.831、0.817﹣0.903、0.854﹣0.944、1.000、1.090﹣1.205、1.132﹣1.251、1.267﹣1.401、1.307﹣1.438、1.365﹣1.509、1.393﹣1.540、1.522﹣1.683。

实验例3：HPLC特征图谱检测方法的方法学考察实验

1、精密度试验

取批号为20150403批螃蟹甲样品，按上述供试品溶液的制备方法得到的供试品溶液一份，在上述色谱条件下连续进样5次测定，结果表明：本发明提供的特征图谱检测方法精密度良好。测定结果见表1。

表1 螃蟹甲HPLC特征图谱精密度考察结果(相对保留时间)

2、重复性试验

取批号为20150403批螃蟹甲样品，按上述供试品溶液的制备方法得到的供试品溶液六份，在上述色谱条件下进样测定，结果表明：本发明提供的特征图谱检测方法重复性良好。测定结果见表2。

表2 螃蟹甲HPLC特征图谱重复性考察结果(相对保留时间)

3、稳定性试验

取批号为20150403批螃蟹甲样品，按上述供试品溶液的制备方法得到的供试品溶液一份，在上述色谱条件下分别在0小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时进样测定，结果表明：本发明提供的特征图谱检测方法稳定性良好。测定结果见表3。

表3 螃蟹甲HPLC特征图谱稳定性考察结果(相对保留时间)

下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。

实施例1：一种藏药螃蟹甲的检测方法，包括

A、薄层鉴别方法

取螃蟹甲药材粉末1g，加乙醇10ml，加热回流30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；同法制得对照药材溶液。取上述两种溶液各5μl点于同一硅胶GF254薄层板上，照薄层色谱法试验，以体积比6:1:0.2的异丙醇﹣甲醇﹣甲酸为展开剂展开，取出晾干，置254nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，和，喷以体积比10％硫酸乙醇溶液显色，在105℃加热至斑点显色清晰，在供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

B、HPLC特征图谱检测方法

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈﹣体积分数比为0.05％的磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱：乙腈体积百分变化为，0﹣15分钟保持4％，15﹣60分钟由12％升至40％；检测波长为245nm；流速：1.0ml/min；分析时间60分钟；

对照品溶液的制备：取山栀苷甲酯对照品适量，加甲醇制成每1ml含山栀苷甲酯0.2mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取藏药螃蟹甲粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录60分钟内的色谱图，即得螃蟹甲的HPLC特征图谱。

实施例2：根据实施例1中HPLC检测方法得到特征图谱，其中特征峰为13个，其中6号峰山栀苷甲酯为标准峰，13个峰与标准峰的相对保留时间分别为0.140、0.382、0.791、0.860、0.899、1.000、1.148、1.191、1.334、1.369、1.437、1.466、1.602。

实施例3：一种藏药螃蟹甲的检测方法

薄层鉴别方法，步骤如下：

取螃蟹甲药材粉末1g，加乙醇10ml，加热回流30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；同法制得对照药材溶液。取上述两种溶液各5μl点于同一硅胶GF254薄层板上，照薄层色谱法试验，以体积比6:1:0.2异丙醇﹣甲醇﹣甲酸为展开剂，展开，取出，晾干。显色方法为：置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

实施例4：一种藏药螃蟹甲的检测方法

为薄层鉴别方法，操作步骤同实施例3，显色方法为：喷以体积比10％硫酸乙醇溶液显色，在105℃加热至斑点显色清晰。在供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

实施例5：一种藏药螃蟹甲的检测方法

HPLC特征图谱检测方法，步骤如下：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈(A)﹣体积分数比为0.05％的磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱：0﹣15分钟乙腈保持4％，15﹣60分钟乙腈由12％升至40％；检测波长为245nm；流速：1.0ml/min；分析时间：60分钟。

对照品溶液的制备：取山栀苷甲酯对照品适量，加甲醇制成每1ml含山栀苷甲酯0.2mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取藏药螃蟹甲粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录60分钟内的色谱图，即得螃蟹甲的特征图谱。