测定蚓激酶注射剂中高分子蛋白和小分子杂质含量的方法与流程

本发明涉及一种采用高效液相色谱法测定蚓激酶注射剂中高分子蛋白和小分子杂质含量的方法。

背景技术：

从安全性角度考虑，患者在使用含有高分子蛋白和小分子杂质的注射剂之前需要进行皮试试验。但皮试试验仅能对速发型I型变态反应有预测作用，且阳性符合度仅30％。即使皮试试验呈阴性也不能说明以后不会发生过敏反应，而临床可能出现的II、III、IV型变态反应是皮试试验无法预测的。

因此，为了确保临床用药的安全性，对注射剂中高分子蛋白和小分子杂质的含量要同时进行检测，对可能带入的高分子蛋白和小分子杂质进行有效地监控，进而从源头上控制了临床过敏反应的发生。这样做既可以节约宝贵的临床急救时间(因注射剂在临床上大多数为急救用药，进行皮试试验必然浪费抢救时间)，同时也提高了临床医护人员与患者的便利性，并减轻了患者的用药痛苦，意义重大。

本发明人从1999年开始先后申请并获得两项蚓激酶工艺发明专利证书(CN1089369C/CN1128220C)，注射用蚓激酶的质量研究和质量标准的确定首先在中国药品生物制品检定所生化药物室完成；后经吉林省药品检定所的技术复核，确定了蚓激酶溶液的质量标准。质量标准规定不得检出高分子蛋白和小分子杂质相对百分含量之和不得过5％。

2002年，本发明人开始进行蚓激酶注射液研发工作，其质量标准再次经过北京市药品检定所的技术复核，质量标准同样规定不得检出高分子蛋白和小分子杂质相对百分含量之和不得过5％。

因此，本单位作为药品注册申请人，于2003年和2005年已经先后在国家食品药品监督管理局获得了注射用蚓激酶(批件号为2003L01103)和蚓激酶注射液(2005L01954)的药物临床研究批件，并分别完成61例健康志愿者的注射用蚓激酶和92例健康志愿者的蚓激酶注射液I期临床研究。由于在工艺和检测两个方面同时严格控制无高分子蛋白以及小分子杂质相对百分含量之和不得过5％。因此，不仅每个批次的豚鼠的过敏试验呈阴性，而且两次I期临床研究的皮试试验的筛选过程均呈阴性。两次I期临床研究的共153例健康志愿者经单次给药和多次给药均未发生过敏性不良反应。这为蚓激酶溶液同时检测高分子蛋白和小分子杂质百分含量之和提供检测方法，进而为代替人体皮试试验过敏方法提供了临床依据。

上述事实证明：对人而言，虽然蚓激酶是分子量在2-4万之间的外源性蛋白，但只要纯度达到本专利规定的标准，就不会对人体产生过敏反应。本发明的实际效果已经颠覆了本研究领域目前的错误观点，那就是蚓激酶作为分子量在2-4万之间的外源性蛋白，其在静脉的应用必将引起过敏反应。这个错误的观点不仅导致有人想采用酶切天然蚓激酶获取具有抗栓活性的小分子片断的方法来解决蚓激酶的过敏问题(如CN101255412A)，而且让更多的人想采用甲氧基聚乙二醇化学修饰的方法来解决蚓激酶的过敏问题(如CN102787109A、CN102660523B和CN103289981A)；这不仅增加了工艺难度，产生了化学污染，而且产品的比活力较低，仅仅每毫克≥3万IU(CN102660523B)。

技术实现要素：

发明目的：

一种测定蚓激酶注射剂中高分子蛋白和小分子杂质含量的方法。该方法用蚓激酶本身作为参照物，采用高效液相色谱法测定在蚓激酶主峰保留时间之前无高分子蛋白峰；同时用胰岛素作为参照物，测定在胰岛素峰保留时间之后的小分子杂质含量。

由于蚓激酶溶液是制备蚓激酶注射剂的中间体，而且没有制剂辅料干扰检测。因此，作为本发明一个实施方案，本发明提供一种同时测定蚓激酶溶液中高分子蛋白和小分子杂质含量的方法。

其方法如下：

取供试品溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图；另取胰岛素对照品适量，用流动相制成每1mL中含1mg的溶液，取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。在供试品色谱图中，其主峰前不得检出高分子蛋白峰；在胰岛素保留时间之后，如出现小分子杂质峰，按峰面积归一化法计算相对百分含量应不大于5.0％。

其中，作为优选方案，所述的高效液相色谱法的色谱条件：色谱柱为凝胶填充剂(如TSK GEL-2000SW，7.8mm×300mm)；流动相为三氟醋酸-乙氰-水，体积比可以为0.025～0.10∶8～30∶70～92，优选为0.05∶10∶90；检测波长为280±1nm，流速为0.5～1.0mL/min，优选流速为0.7mL/min。理论板数按蚓激酶峰计算应不小于700。

同时测定高分子蛋白和小分子杂质的一般方法包括薄层色谱法、高效液相色谱法和电泳法等。本发明优选采用高效液相色谱法(HPLC)测定。用蚓激酶本身作为参照物，测定在蚓激酶主峰保留时间之前的高分子蛋白；同时用胰岛素作为参照物，测定在胰岛素保留时间之后的小分子杂质峰。色谱条件：色谱柱用凝胶为填充剂，流动相的基本组成为水、有机溶剂和三氟醋酸，以及紫外检测器，其中所述的有机溶剂为乙腈、甲醇和丙酮等。

蚯蚓在中药中称为地龙，其蛋白提取物同时具有纤溶酶原激活活性和纤维蛋白溶解活性。因此，注射用蚓激酶也可以被称作蚯蚓纤溶酶冻干粉针和注射用地龙冻干粉针，三者实际上是同一物质(例如CN1128220C/CN1520829A/CN1537938A/CN101407801B)。

本发明所述的注射剂(Injection of Lumbrokinase)的剂型包括药物制成的注入人体体内的灭菌溶液、乳状液和混悬液以及供临用前配成溶液或混悬液的无菌粉末，例如注射用浓溶液、溶液型注射剂、注射用无菌粉末、混悬型注射剂和乳悬型注射剂。

本发明所述的注射剂可能含有高分子蛋白和小分子杂质，高分子蛋白的分子量大于蚓激酶的平均分子量(25000)；小分子杂质的分子量小于胰岛素分子量5808。本发明所述的蚓激酶溶液是从鲜活的蚯蚓中提取并分离的符合静脉注射要求的蚓激酶浓溶液，它不仅浓度高达1mg/mL，而且每毫克的比活力≥14万IU，进而经注射用水稀释后可以制成无菌粉针剂和水针剂(例如CN1128220C)。

上述定量分析方法，具有快速、准确、灵敏度高、干扰少等特点，可以有效地对蚓激酶注射剂中高分子蛋白和小分子杂质进行检测和监控，进而从源头上控制临床过敏反应的发生，并取消皮试试验，减轻患者用药的痛苦，节约临床上宝贵的急救时间。

附图说明

图1：牛血清白蛋白(分子量66446)色谱图

图2：胰岛素(分子量5808)色谱图

图3：酪氨酸(分子量181.2)色谱图

图4：三种标准分子量物质混合进样色谱图

图5：蚓激酶溶液(批号991216)色谱图

图6：蚓激酶溶液(批号20000104)色谱图

图7：蚓激酶溶液(批号20000105)色谱图

具体实施方式

一、试验材料与仪器

1、标准分子量物质

2、试剂

三氟醋酸 化学纯(理工大学化学与材料学院)

乙腈 色谱纯(迪马公司)

3、仪器

可见紫外分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司UV-2000)

高效液相色谱仪 日本岛津2010A

色谱条件：

色谱柱：凝胶填充剂(TSK GEL-2000SW，7.8mm×300mm)；

流动相：三氟醋酸-乙氰-水，体积比为0.05∶10∶90；

紫外检测器，检测波长为280±1nm

流速为0.7mL/min

二、实施案例

以下通过实例进一步说明本发明，但不构成对本发明保护范围的限制。

实施例1：测定标准分子量物质的线性定量范围

取标准分子量物质，牛血清白蛋白66446，人胰岛素5808，酪氨酸181.2，分别加流动相溶解成1mg/mL的浓度，取适量样品分析，测定结果见表1和图1-4。

表1 线性试验结果

试验结果表明，该方法对分子量66446-181范围是呈线性分离的，既以分子量对数为纵坐标，以保留时间为横坐标，用最小二乘法，进行线性回归计算，方程：LogM＝7.767-0.3905t_R，线性关系r＝-0.9972。

实施例2 重复性试验

取胰岛素标准品适量，加流动相稀释成0.8mg/mL、1.0mg/mL和1.2mg/mL，分别测定3次，结果见表2。

表2 重复性试验结果

试验结果说明本发明方法重复性非常好。

实施例3：高效液相色谱法测定蚓激酶溶液中高分子蛋白和小分子杂质含量

测定法取蚓激酶溶液(批号991216、20000104和20000105，1mg/mL，北京儒展生化药物研究中心制备)10μL注入液相色谱仪，记录色谱图；另取胰岛素对照品适量，用流动相制成每1mL中含1mg的溶液，取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。在蚓激酶溶液色谱图中，其主峰的保留时间之前不得检出高分子蛋白峰；在胰岛素峰的保留时间之后，如出小分子杂质峰，按峰面积归一化法计算应不大于5.0％。结果见表3和图5-7。

表3 蚓激酶溶液中高分子蛋白和小分子杂质含量的测定结果

实施例4 蚓激酶溶液不同浓度样品对保留时间测定的影响

取蚓激酶溶液(991216)，分别加流动相稀释成如下浓度：1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL和0.125mg/mL。按照实施例3所述方法测定，结果见表4。

表4、浓度对测定的影响

试验结果说明，本发明方法，供试品在用流动相稀释至1-8倍后，其测定结果几乎无变化。

实施例5：稳定性试验

取蚓激酶溶液(991216)，室温放置，分别在0、1、2、3、4、5小时注入测定。按照实施例3所述方法测定，结果见表5。

表5 稳定性试验

试验结果说明，本发明方法在5小时内测定蚓激酶溶液是可靠的。

实施例6：精密度试验

取蚓激酶溶液(991216)，连续进样5次。按照实施例3所述方法测定，结果见表6。

表6 精密度试验

结果表明，本发明精密度符合要求。