一种基于代谢组学手段判别不同耐逆潜力大豆的方法与流程

本发明涉及分析化学的技术领域，更具体地讲，涉及一种基于代谢组学手段判别不同耐逆潜力大豆的方法。

背景技术：
作物野生种质资源的评价、筛选是优质品种选育的基础，根据作物育种方向有针对性地开展农艺性状、品质性状的评价工作极为重要，合理有效的评价方法的采用可大大缩减优质品种选育的进程。以抗田间霉变大豆及耐荫性优质大豆品种的选育为例：1)南方夏大豆收获期正值连阴雨高湿天气，籽粒霉变严重，产量损失大，危害食品安全，抗田间霉变大豆品种的选育迫在眉睫；田间霉变抗性品种的评价、筛选往往要在大田范围内广泛开展，实施霉变诱导处理后，对霉变程度进行等级划分，并测定多个农艺性状及品质性状指标，综合上述信息才能达到大豆抗田间霉变能力评价的目的。2)西南华南间套种食用大豆产区是我国大豆三大优势产区之一，而套作荫蔽条件下，高秆作物的荫蔽作用导致大豆营养生长受阻，光合产能不足，品质形成受到影响，选育具有耐荫特性，适合套作荫蔽环境的大豆优质品种是解决这一瓶颈问题的突破口之一，而耐荫型大豆种质资源的评价、筛选需要多年的大田品比试验，通过监测比较净、套作大豆生长过程中多个生理指标、农艺性状的表现，从而达到耐荫大豆种质资源评价、筛选的目的。上述两例中，大豆资源评价的过程耗时长、费工费力，若评价对象的数量过于庞大时，操作将更加繁琐；且可能因为特殊气候原因导致评价不合理、不真实，或更难达到预期目的，实践中亟需一种能够快速、高效评价大豆耐逆潜力的方法。

技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是基于高效液相色谱质谱联用系统进行大豆种子代谢图谱分析并对不同耐逆潜力的大豆种子代谢差异进行研究和判别，进而提供一种基于代谢组学手段判别不同耐逆潜力大豆的方法。本发明提供了一种基于代谢组学手段判别不同耐逆潜力大豆的方法，通过检测大豆种子中多种大豆异黄酮的绝对含量并筛选出对大豆的耐逆潜力影响显著的一种或多种大豆异黄酮，利用所述一种或多种对大豆的耐逆潜力影响显著的大豆异黄酮及其绝对含量对所述大豆种子的耐逆潜力进行判别，获得具有耐逆潜力的大豆种质资源。根据本发明基于代谢组学手段判别不同耐逆潜力大豆的方法的一个实施例，当待测大豆种子样本中的gl型异黄酮的绝对含量高于0.5mg/g时，所述待测大豆种子样本具有较好的抗田间霉变潜力并且可作为抗霉型重点育种基础材料加以利用，其中，所述gl型异黄酮包括黄豆黄素GLE、黄豆黄苷GLG、丙二酰黄豆黄苷MGL和乙酰黄豆黄苷AGL；当待测大豆种子样本中的E型异黄酮苷元的绝对含量高于90μg/g时，所述待测大豆种子样本具有较好的耐荫潜力并且可作为耐荫型重点育种基础材料加以利用，其中，所述E型异黄酮苷元包括大豆苷元DE、黄豆黄素GLE和染料木素GE。根据本发明基于代谢组学手段判别不同耐逆潜力大豆的方法的一个实施例，所述检测大豆种子中多种大豆异黄酮的绝对含量的步骤包括采用高效液相色谱-质谱联用技术对待测大豆种子样本中的大豆异黄酮含量进行分析并得到大豆异黄酮靶向代谢图谱的步骤和利用所述大豆异黄酮靶向代谢图谱计算得到各种大豆异黄酮的绝对含量的步骤。根据本发明基于代谢组学手段判别不同耐逆潜力大豆的方法的一个实施例，所述采用高效液相色谱-质谱联用技术对待测大豆种子样本中的大豆异黄酮含量进行分析并得到大豆异黄酮靶向代谢图谱的步骤包括以下子步骤：a、将待测大豆种子样本粉碎后得到豆粉，将所述豆粉储存于-80～-60℃的环境下备用；b、取所述豆粉置于真空干燥机干燥后冷却至室温，再称取豆粉置于带盖离心管中，加入甲醇水溶液并控制料液比为40:1～20:1，密封震荡后进行超声提取，离心后取上清液并将上清液经过滤膜过滤后进样瓶，将所得样品在-70～-20℃下保存待测；c、对样品进行高效液相色谱-质谱联用分析，获得所述待测大豆种子样本的提取离子流图，即为所述大豆异黄酮靶向代谢图谱。根据本发明基于代谢组学手段判别不同耐逆潜力大豆的方法的一个实施例，在子步骤c中，高效液相色谱系统的参数条件包括：采用反相C18色谱柱，其中，流动相A为纯乙腈，流动相B为体积浓度0.1％乙酸水溶液，以A(V/V)：0min15％、0～30min20％、30～60min40％、60～70min40％的梯度洗脱；流速梯度为：0min1.0ml/min、0～30min0.8ml/min、30～60min0.8ml/min、60～70min1.0ml/min；洗脱延迟时间为5～10min，随后起始梯度平衡5～10min，流速控制为0.8～1.2ml/min；柱后流出液不经分流直接导入质谱系统进行检测；质谱系统的参数条件包括：采用电喷雾离子源并采用正离子模式检测，其中，使用高纯N2辅助喷雾电离与脱溶剂，控制干燥气流速为10～14L/min，雾化室压力为30～42psig，干燥器温度为340～360℃，毛细管电压为3200～3800V，质量扫描范围为m/z100～700。根据本发明基于代谢组学手段判别不同耐逆潜力大豆的方法的一个实施例，进行质谱分析时，选定m/z417、m/z447分别进行大豆苷DG和黄豆黄苷GLG的采集并分别控制采集时间为12～20min；选定m/z433、m/z503、m/z533分别进行染料木苷GEG、丙二酰大豆苷MD和丙二酰黄豆黄苷MGL的采集并分别控制采集时间为28～38min；选定m/z459、m/z489、m/z519分别进行乙酰大豆苷AD、乙酰黄豆黄苷AGL和丙二酰染料木苷MG的采集并分别控制采集时间为40～48min)；选定m/z255、m/z475、m/z285分别进行大豆苷元DE、乙酰染料木苷AG和黄豆黄素GLE的采集并分别控制采集时间为48～54min；选定m/z271进行染料木素GE的采集并控制采集时间为60～65min。根据本发明基于代谢组学手段判别不同耐逆潜力大豆的方法的一个实施例，所述利用所述大豆异黄酮靶向代谢图谱计算得到各种大豆异黄酮的绝对含量的步骤包括以下子步骤：i、分别精确称量1.0mg大豆异黄酮的标准样品，其中，所述大豆异黄酮包括大豆苷DG、黄豆黄苷GLG、染料木苷GEG、丙二酰大豆苷MD、丙二酰黄豆黄苷MGL、乙酰大豆苷AD、乙酰黄豆黄苷AGL、丙二酰染料木苷MG、大豆苷元DE、乙酰染料木苷AG、黄豆黄素GLE和染料木素GE；ii、将每种大豆异黄酮的标准样品分别溶于10～20μLDMSO并以纯乙腈定容至10ml，控制溶液中大豆异黄酮的浓度为100μg/ml；平衡20～30min后，以纯乙腈分别稀释为75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、4μg/ml的梯度标准溶液，按照所述高效液相色谱系统和质谱系统的参数条件由低到高进样，记录各种大豆异黄酮含量的标准曲线；iii、根据所述大豆异黄酮靶向代谢图谱中各种大豆异黄酮的峰面积参数并对照所述各种大豆异黄酮含量的标准曲线进行回归分析，计算得到各种大豆异黄酮的绝对含量。根据本发明基于代谢组学手段判别不同耐逆潜力大豆的方法的一个实施例，所述筛选出对大豆的耐逆潜力影响显著的一种或多种大豆异黄酮的步骤包括以下子步骤：Ⅰ、将检测得到的大豆种子中多种大豆异黄酮的绝对含量形成一个数据矩阵，其中，所述大豆异黄酮包括大豆苷DG、黄豆黄苷GLG、染料木苷GEG、丙二酰大豆苷MD、丙二酰黄豆黄苷MGL、乙酰大豆苷AD、乙酰黄豆黄苷AGL、丙二酰染料木苷MG、大豆苷元DE、乙酰染料木苷AG、黄豆黄素GLE和染料木素GE；Ⅱ、将所述数据矩阵中的变量进行标度化后利用正交偏最小二乘-判别分析方法对数据矩阵进行统计分析，对大豆种子的代谢指纹数据进行建模，根据模型中的变量重要性因子筛选对分类有重要贡献的大豆异黄酮；Ⅲ、对筛选出的大豆异黄酮进行t检验，结合实际检测耐逆潜力表型选出含量差异显著的大豆异黄酮，并将其作为对大豆的耐逆潜力影响显著的一种或多种大豆异黄酮。根据本发明基于代谢组学手段判别不同耐逆潜力大豆的方法的一个实施例，根据现有的大豆种子样本信息将所述对大豆的耐逆潜力影响显著的一种或多种大豆异黄酮及其绝对含量与大豆种子的耐逆潜力建立关联，形成判别标准。根据本发明基于代谢组学手段判别不同耐逆潜力大豆的方法的一个实施例，从多个大豆种子样本中随机抽取一个或多个样品的混合物设为质量控制样本，在对大豆种子样本获得的样品进行高效液相色谱-质谱联用分析的过程中，每分析5～10个样本后，将所述质量控制样本进样一次并通过保证质量控制样本的提取离子流图的重复性来确保分析过程中仪器的运行稳定性。与现有技术相比，本发明采用真实异黄酮标准品标定测试样本中大豆异黄酮的绝对含量，标准曲线一旦建立，后续样本前处理、分析测试工作均采用标准化程序处理，操作简单、误差小，数据可靠。采用基于高效液相色谱-质谱联用技术平台的代谢组学研究平台，尤其是提取离子模式(SIM)的应用，可有效实现微量大豆异黄酮含量的准确测定；新型多元回归建模方法正交偏最小二乘-判别分析(O2PLS-DA)的应用，与传统方法相比，该方法不仅能去除光谱数据中的干扰信号，而且可以去除浓度数据中最大的有效信息，剔除了与样品成分浓度含量无关的主成分，所提取的成分对浓度数据有较大的贡献率，使得预测精度更高。此外，本发明操作简单便捷、结果准确可靠且样品用量少，适合于大量样本的批量分析，可为大豆代谢特征分析及相关的代谢组学研究提供借鉴。附图说明图1示出了利用大豆种子样本的提取物获得的典型大豆异黄酮靶向代谢图谱。图2A示出了示例1中针对9种大豆种子样本构建得到的模型的得分矩阵图，其中，○为高度感菌大豆，■为中度感菌大豆，Δ为高抗菌大豆；每个点表示一个样品，t表示样本在主成分投影值。图2B示出了示例1中针对9种大豆种子样本构建得到的模型的载荷矩阵图。图3A示出了示例2中针对8种大豆种子样本构建得到的模型的得分矩阵图，其中，○为强耐荫大豆，■为弱耐荫大豆，Δ为中度耐荫大豆；每个点表示一个样品，t表示样本在主成分投影值。图3B示出了示例2中针对8种大豆种子样本构建得到的模型的载荷矩阵图。具体实施方式本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。本说明书(包括任何附加权利要求、摘要和附图)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。下面将对本发明基于代谢组学手段判别不同耐逆潜力大豆的方法进行详细的说明。总体地讲，本发明是一种基于高效液相色谱-质谱联用系统进行大豆种子代谢图谱分析，然后用多变量统计方法区分不同抗逆性大豆数据并发现对代谢表型差异有重要贡献的化合物，从而对不同抗逆性大豆种子代谢差异进行研究的方法。该方法具有操作简单快速、结果可靠的优点，可以为具有抗逆潜力的优质大豆种质资源的判定、筛选提供参考，并为大豆抗逆性机理的深入研究提供依据。大豆异黄酮是大豆中含有的重要次生代谢产物，其除了具有抗癌、改善骨质疏松、改善妇女更年期症状、防止心血管疾病、防止脂质过氧化、预防糖尿病等多种生物活性以外，还在多种豆科植物抵抗逆境过程中发挥着重要的生态作用，如避免紫外辐射的伤害，抵抗植物病原微生物的侵袭，对草食性昆虫具有毒害作用和趋避作用，缓解盐渍环境胁迫，诱导根瘤菌结瘤基因等重要生理抗性物质。大豆异黄酮无疑在植物生理耐逆抗性中起到了重要作用。大豆主要含有12种异黄酮，按照异黄酮衍生化类型，可分为异黄酮苷元(E型)：大豆苷元(DE)、黄豆黄素(GLE)、染料木素(GE)；异黄酮葡萄糖苷(G型)：大豆苷(DG)、染料木苷(GEG)、黄豆黄苷(GLG))；乙酰异黄酮苷(A型)：乙酰大豆苷(AD)、乙酰染料木苷(AG)、乙酰黄豆黄苷(AGL)；丙二酰基异黄酮苷(M型)：丙二酰大豆苷(MD)、丙二酰染料木苷(MG)、丙二酰黄豆黄苷(MGL)。按照异黄酮的基本结构骨架，也可分为d型(DE、DG、AD、MD)；gl型(GLE、GLG、AGL、MGL)；g型(GE、GEG、AG、MG)。其中以丙二酰基异黄酮苷(MD、MG、MGL)和异黄酮葡萄糖苷(DG、GEG、GLG)的含量最高，但不同化学结构异黄酮的生理活性不同，黄酮母核、取代基、取代模式及数目都可能会对其活性产生影响。已有研究表明，天然黄酮类分子中的α、β不饱和吡喃酮是发挥各种生物活性的关键，C环C-2，3位双键氢化及糖苷化均易导致其活性降低，绝大多数黄酮苷的活性低于其苷元；一般情况下母核上的羟基取代程度越大，活性越强，邻位羟基取代往往对活性有利。根据本发明的示例性实施例，所述基于代谢组学手段判别不同耐逆潜力大豆的方法是通过检测大豆种子中多种大豆异黄酮的绝对含量并筛选出对大豆的耐逆潜力影响显著的一种或多种大豆异黄酮，利用所述一种或多种对大豆的耐逆潜力影响显著的大豆异黄酮及其绝对含量对所述大豆种子的耐逆潜力进行判别，获得具有耐逆潜力的大豆种质资源。根据本发明的优选实施例，当待测大豆种子样本中的gl型异黄酮的绝对含量高于0.5mg/g时，所述待测大豆种子样本具有较好的抗田间霉变潜力并且可作为抗霉型重点育种基础材料加以利用，其中，所述gl型异黄酮包括黄豆黄素GLE、黄豆黄苷GLG、丙二酰黄豆黄苷MGL和乙酰黄豆黄苷AGL；当待测大豆种子样本中的E型异黄酮苷元的绝对含量高于90μg/g时，所述待测大豆种子样本具有较好的耐荫潜力并且可作为耐荫型重点育种基础材料加以利用，其中，所述E型异黄酮苷元包括大豆苷元DE、黄豆黄素GLE和染料木素GE。但是，本发明中不限于根据待测大豆种子样本中gl型异黄酮的绝对含量判别其抗田间霉变潜力，也不限于根据大豆种子样本中E型异黄酮苷元的绝对含量判别大豆耐荫潜力。凡利用本发明所述方法并以其他异黄酮的绝对含量判别大豆其他耐逆性的方法均属本发明权利保护之范围。下面先对本发明检测大豆种子中多种大豆异黄酮的绝对含量的具体步骤进行说明。根据本发明，所述检测大豆种子中多种大豆异黄酮的绝对含量的步骤包括采用高效液相色谱-质谱联用技术对待测大豆种子样本中的大豆异黄酮含量进行分析并得到大豆异黄酮靶向代谢图谱的步骤和利用所述大豆异黄酮靶向代谢图谱计算得到各种大豆异黄酮的绝对含量的步骤。获取植物代谢图谱所涉及的方法种类繁多，主要采用色谱方法分离特征成分，采用UV、IR、NMR、MS等光谱方法鉴定化合物的结构，主要方法有GC-MS、HPLC-MS、NMR等。植物代谢图谱形象地反映了物种具有遗传特性的代谢物群体的“整体确定性(共有特征)”，而地域、生长环境、采收等多种不定因素对植物代谢存在重要影响，具有统计学中多元随机分布的“模糊性(非共有特征)”。利用模糊数学、统计学、计算机技术建立同时反映此两种特征的方法，并基于化学计量学、数据挖掘技术等方法，可实现植物系统、科学、客观的有效评价，进而判别种质资源的优劣。本发明主要是采用基于高效液相色谱-质谱联用技术平台的代谢组学研究平台，尤其是提取离子模式(SIM)的应用，有效实现了微量异黄酮含量的准确测定，并通过获取大豆异黄酮靶向代谢图谱来计算得到各种大豆异黄酮的绝对含量。其中，采用高效液相色谱-质谱联用技术对待测大豆种子样本中的大豆异黄酮含量进行分析并得到大豆异黄酮靶向代谢图谱的步骤包括以下子步骤：a、将待测大豆种子样本粉碎后得到豆粉，将豆粉储存于-80～-60℃的环境下备用。其中，优选地将豆粉过60目筛以获得更细的粉末，有利于后续的分析和处理。b、取豆粉置于真空干燥机干燥后冷却至室温，再称取豆粉置于带盖离心管中，加入甲醇水溶液并控制料液比为40:1～20:1，密封震荡后进行超声提取，离心后取上清液并将上清液经过滤膜过滤后进样瓶，将所得样品在-70～-20℃下保存待测。其中，优选地选择甲醇体积浓度为80％的甲醇水溶液。c、对样品进行高效液相色谱-质谱联用分析，获得待测大豆种子样本的提取离子流图，即为大豆异黄酮靶向代谢图谱。在子步骤c中，高效液相色谱系统的参数条件包括：采用反相C18色谱柱，其中，流动相A为纯乙腈，流动相B为体积浓度0.1％乙酸水溶液，以A(V/V)：0min15％、0～30min20％、30～60min40％、60～70min40％的梯度洗脱；流速梯度为：0min1.0ml/min、0～30min0.8ml/min、30～60min0.8ml/min、60～70min1.0ml/min；洗脱延迟时间为5～10min，随后起始梯度平衡5～10min，流速控制为0.8～1.2ml/min；柱后流出液不经分流直接导入质谱系统进行检测。其中，流动相A与流动相B混合使用并进行洗脱，并且在不同的阶段采用不同的混合比例，例如，在0min时，采用15％的流动相A和85％的流动相B；在0～30min内，采用20％的流动相A和80％的流动相B，以此类推，其中，二者的配比均为体积比。质谱系统的参数条件包括：采用电喷雾离子源并采用正离子模式检测，其中，使用高纯N2辅助喷雾电离与脱溶剂，控制干燥气流速为10～14L/min，雾化室压力为30～42psig，干燥器温度为340～360℃，毛细管电压为3200～3800V，质量扫描范围为m/z100～700。根据本发明的一个实施例，进行质谱分析时，选定m/z417、m/z447分别进行大豆苷DG和黄豆黄苷GLG的采集并分别控制采集时间为12～20min；选定m/z433、m/z503、m/z533分别进行染料木苷GEG、丙二酰大豆苷MD和丙二酰黄豆黄苷MGL的采集并分别控制采集时间为28～38min；选定m/z459、m/z489、m/z519分别进行乙酰大豆苷AD、乙酰黄豆黄苷AGL和丙二酰染料木苷MG的采集并分别控制采集时间为40～48min；选定m/z255、m/z475、m/z285分别进行大豆苷元DE、乙酰染料木苷AG和黄豆黄素GLE的采集并分别控制采集时间为48～54min；选定m/z271进行染料木素GE的采集并控制采集时间为60～65min。之后，即可获得被分析样本的提取离子流图，即大豆异黄酮靶向代谢图谱。根据本发明，利用所获得的大豆异黄酮靶向代谢图谱计算得到各种大豆异黄酮的绝对含量的步骤实际上是靶向代谢物的定量分析步骤，其包括以下子步骤：i、分别精确称量1.0mg大豆异黄酮的标准样品，其中，所述大豆异黄酮包括大豆苷DG、黄豆黄苷GLG、染料木苷GEG、丙二酰大豆苷MD、丙二酰黄豆黄苷MGL、乙酰大豆苷AD、乙酰黄豆黄苷AGL、丙二酰染料木苷MG、大豆苷元DE、乙酰染料木苷AG、黄豆黄素GLE和染料木素GE；ii、将每种大豆异黄酮的标准样品分别溶于10～20μLDMSO并以纯乙腈定容至10ml，控制溶液中大豆异黄酮的浓度为100μg/ml；平衡20～30min后，以纯乙腈分别稀释为75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、4μg/ml的梯度标准溶液，按照所述高效液相色谱系统和质谱系统的参数条件由低到高进样，记录各种大豆异黄酮含量的标准曲线；iii、根据所述大豆异黄酮靶向代谢图谱中各种大豆异黄酮的峰面积参数并对照所述各种大豆异黄酮含量的标准曲线进行回归分析，计算得到各种大豆异黄酮的绝对含量。优选地，从多个大豆种子样本中随机抽取一个或多个样品的混合物设为质量控制样本，在对大豆种子样本获得的样品进行高效液相色谱-质谱联用分析的过程中，每分析5～10个样本后，将所述质量控制样本进样一次并通过保证质量控制样本的提取离子流图的重复性来确保分析过程中仪器的运行稳定性。在获得大豆种子样本中各种大豆异黄酮的绝对含量之后，需对其进行分析和识别，从而筛选出对大豆的耐逆潜力影响显著的一种或多种大豆异黄酮，并利用该一种或多种对大豆的耐逆潜力影响显著的大豆异黄酮及其绝对含量对大豆种子的耐逆潜力进行判别，获得具有耐逆潜力的大豆种质资源。接下来，对筛选出对大豆的耐逆潜力影响显著的一种或多种大豆异黄酮的具体步骤进行详细说明。化学模式识别技术是根据物质所含化学成分信息，用计算机对其进行分类或描述，其能够较好地迎合代谢图谱整体性和模糊性的要求，分为非监督方法和监督方法两类。非监督方法针对那些不利用或没有样本所属类别信息的情况，它将复杂的数据降低到一个低维空间，以分类图的形式显示出来，从而使肉眼能够进行系统分析。常用的非监督方法主要方法包括：主成分分析(PCA)和系统聚类分析(HCA)两类。监督方法的基本思路是用一组已知类别的样本作为训练集，即用已知的样本进行训练，并由这个训练集得到判别模型，再去识别未知样本。常用的监督方法包括：簇类独立软模式分类法(SIMCA)、偏最小二乘法(PLS)、K邻域判别法(KNN)、神经网络(NN)、线性判别分析(LDA)。正交偏最小二乘-判别分析(OPLS-DA)是新发展起来的数据分析方法，可以将正交信号校正方法(OSC)与偏最小二乘法(PLS)结合并对PLS进行修正，在代谢组学研究中其判别能力优于主成分分析法。本发明主要利用了正交偏最小二乘-判别分析(OPLS-DA)进行分析并实现多元回归建模，不仅能够去除光谱数据中的干扰信号，而且可以去除浓度数据中最大的有效信息，剔除与样品成分浓度含量无关的主成分，所提取的成分对浓度数据有较大的贡献率，使得预测精度更高。根据本发明，所述筛选出对大豆的耐逆潜力影响显著的一种或多种大豆异黄酮的步骤包括以下子步骤：Ⅰ、将检测得到的大豆种子中多种大豆异黄酮的绝对含量形成一个数据矩阵，其中，所述大豆异黄酮包括大豆苷DG、黄豆黄苷GLG、染料木苷GEG、丙二酰大豆苷MD、丙二酰黄豆黄苷MGL、乙酰大豆苷AD、乙酰黄豆黄苷AGL、丙二酰染料木苷MG、大豆苷元DE、乙酰染料木苷AG、黄豆黄素GLE和染料木素GE；Ⅱ、将所述数据矩阵中的变量进行标度化后利用正交偏最小二乘-判别分析方法对数据矩阵进行统计分析，对大豆种子的代谢指纹数据进行建模，根据模型中的变量重要性因子筛选对分类有重要贡献的大豆异黄酮，这些代谢物可被认为是在具有不同抗逆潜力大豆种质资源分类中起重要作用的化合物。Ⅲ、对筛选出的大豆异黄酮进行t检验，结合实际检测耐逆潜力表型选出含量差异显著的大豆异黄酮，并将其作为对大豆的耐逆潜力影响显著的一种或多种大豆异黄酮。更优选地，在获取对大豆的耐逆潜力影响显著的一种或多种大豆异黄酮之后，可以根据现有的大豆种子样本信息将所述对大豆的耐逆潜力影响显著的一种或多种大豆异黄酮及其绝对含量与大豆种子的耐逆潜力建立关联，形成判别标准，由此可以根据大豆种子样本中相应大豆异黄酮及其绝对含量来快速、高效地评价大豆的不同耐逆潜力。下面结合示例对本发明的基于代谢组学手段判别不同耐逆潜力大豆的方法作进一步说明。示例1：本示例待测大豆样本包括四川、重庆、广西等西南地区搜集得到的9个大豆种质资源，包括野生资源和西南大豆生产中常用的典型品种及未审定的育种中间材料，大豆种子样本信息如表1所示。表1示例1中9种不同抗田间霉菌特性大豆的材料信息首先，将各样本采集后进行粉碎并过60目筛，再将所得豆粉储存于-80℃的超低温冰箱中备用。其次，各样本的豆粉分析步骤如下：1)准确称量200.0mg豆粉，置于10mL的带盖离心管中，加入体积浓度为80％的甲醇水溶液5mL(控制料液比为40:1)；密封后置于漩涡振荡器中震荡10s，再于40℃下超声(40KHz，300w)提取3小时，11000×g离心10min，取上清液约1.5mL并过0.22μm滤膜(有机相针式滤头)至2mL进样瓶，置于-20℃的环境下保存待测。2)高效液相色谱HPLC-MS(AgilentQuadrupoleLC/MS6120)的具体参数条件：色谱柱YMC-packODS-AQ(4.6×250mm，S-5μm,12nm)，流动相A为100％的纯乙腈，流动相B为体积浓度为0.1％的乙酸水溶液，以A(V/V)：0min15％、0～30min20％、30～60min40％、60～70min40％梯度洗脱；流速梯度：0min1.0ml/min、0～30min0.8ml/min、30～60min0.8ml/min、60～70min1.0ml/min；洗脱延迟时间5min，随后起始梯度平衡5min，流速1.0ml/min；柱后流出液不经分流直接导入质谱系统检测。质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测；使用高纯N2辅助喷雾电离与脱溶剂，干燥气流速为10L/min，雾化室压力为35psig，干燥器温度为350℃，毛细管电压为3800V，质量扫描范围m/z为100～700。选定m/z417、m/z447分别进行大豆苷DG和黄豆黄苷GLG的采集并分别控制采集时间分别为17.7min和19.6min；选定m/z433、m/z503、m/z533分别进行染料木苷GEG、丙二酰大豆苷MD和丙二酰黄豆黄苷MGL的采集并分别控制采集时间为32.9min、36.2min和37.7min；选定m/z459、m/z489、m/z519分别进行乙酰大豆苷AD、乙酰黄豆黄苷AGL和丙二酰染料木苷MG的采集并分别控制采集时间为43.6min、44.9min和46.9min；选定m/z255、m/z475、m/z285分别进行大豆苷元DE、乙酰染料木苷AG和黄豆黄素GLE的采集并分别控制采集时间为51.6min、52.3min和53.0min；选定m/z271进行染料木素GE的采集并控制采集时间为62.9min，继而获得被分析样本的提取离子流图，即为大豆异黄酮靶向代谢图谱。其中，典型的大豆异黄酮靶向代谢图谱如图1所示，其中有十二个峰，分别代表十二种大豆异黄酮，可以根据峰的面积统计得到每种大豆异黄酮的绝对含量。但是，由于本示例中大豆种子样本的数量较多，在此不一一进行图示展示。3)靶向代谢物定量分析：分别精确称量1.0mg大豆异黄酮标准品，溶于20μLDMSO，以色谱纯乙腈定容至10ml(C＝100μg/ml)；平衡20min后，以色谱纯乙腈稀释为75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、4μg/ml浓度的梯度标准溶液；按上述色谱、质谱条件由低到高进样，记录各种大豆异黄酮含量的标准曲线。然后，根据各大豆种子样本对应的大豆异黄酮靶向代谢图谱中各种大豆异黄酮的峰面积参数并对照各种大豆异黄酮含量的标准曲线进行回归分析，计算得到各种大豆异黄酮的绝对含量。4)分别采集获得9个大豆样本的12种异黄酮含量数据，，形成一个9×12的数据矩阵，将数据矩阵中的变量进行标度化后导入SIMCA-P软件(V13.0，UmetricsAB，Umea，Sweden)，利用正交偏最小二乘-判别分析(O2PLS-DA)方法对数据矩阵进行模式识别多变量分析，所建模型具有2个主成分，根据每个样本在主成分上的投影，得到得分矩阵图，具体如图2A所示。从图2A可知，3种高感菌大豆、5种中度感菌大豆和4种高抗性大豆样本的投影在得分矩阵图上可以得到很好的分离，这表明不同霉变抗性的大豆之间存在明显的区别。之后，再根据每个变量在主成分上的投影，得到载荷矩阵图，具体如图2B所示。其中，与得分矩阵图对应的载荷矩阵图反映出导致样本对组间分开作出了贡献的差异代谢物，从图2B可知，化合物DE、GLE、GLG、AGL、MGL离中心点较远，其对区分样本所做贡献较大。将上述5个化合物在典型的高感材料(D15、E60、E70、A13)与高抗材料(A3、D49、2162、C103)的变量信息导入到SPSS，两者间做样本t检验，通过t检验的变量(p<0.05)认为是对不同抗逆潜力大豆种质资源的代谢有显著性差异的化合物，并结合各大豆籽粒实际霉变指数(如表1所示)，对上述判别分类进行验证，可发现gl型异黄酮(GLE、GLG、AGL、MGL)含量高的大豆确实具有更大的抗霉变潜力。当某大豆材料的gl型异黄酮含量高于0.5mg/g时，其具有较好的抗田间霉变潜力，可作为抗霉型重点育种基础材料加以利用。表2示例1中9种不同抗田间霉菌特性大豆的12种异黄酮含量信息示例2：本示例待测大豆样本均来源于四川各地，包括6份地方野生种质资源，1个生产常用栽培品种(南豆12)，1个栽培品种(贡选5号)的田间杂株，大豆种子样本信息如表3所示。表3示例2中8种不同耐荫特性大豆的材料信息首先，将各样本采集后进行粉碎并过60目筛，再将所得豆粉储存于-60℃的超低温冰箱中备用。其次，各样本的豆粉分析步骤如下：1)准确称量200.0mg豆粉，置于10mL的带盖离心管中，加入体积浓度为80％的甲醇水溶液5mL(控制料液比为40:1)；密封后置于漩涡振荡器中震荡10s；再于40℃下超声(40KHz，300w)提取3小时，11000×g离心10min，取上清液约1.5mL过0.22μm滤膜(有机相针式滤头)至2mL进样瓶，置于-20℃的环境下保存待测。2)高效液相色谱HPLC-MS(AgilentQuadrupoleLC/MS6120)的具体参数条件：色谱柱YMC-packODS-AQ(4.6×250mm，S-5μm,12nm)，流动相A为100％的纯乙腈，流动相B为体积浓度为0.1％的乙酸水溶液，以A(V/V)：0min15％、0～30min20％、30～60min40％、60～70min40％梯度洗脱；流速梯度：0min1.0ml/min、0～30min0.8ml/min、30～60min0.8ml/min、60～70min1.0ml/min；洗脱延迟时间2min，随后起始梯度平衡5min，流速1.0ml/min；柱后流出液不经分流直接导入质谱系统检测。质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测；使用高纯N2辅助喷雾电离与脱溶剂，干燥气流速为10L/min，雾化室压力为35psig，干燥器温度为350℃，毛细管电压为为3800V，质量扫描范围m/z为100～700。选定m/z417、m/z447分别进行大豆苷DG和黄豆黄苷GLG的采集并分别控制采集时间分别为17.7min和19.6min；选定m/z433、m/z503、m/z533分别进行染料木苷GEG、丙二酰大豆苷MD和丙二酰黄豆黄苷MGL的采集并分别控制采集时间为32.9min、36.2min和37.7min；选定m/z459、m/z489、m/z519分别进行乙酰大豆苷AD、乙酰黄豆黄苷AGL和丙二酰染料木苷MG的采集并分别控制采集时间为43.6min、44.9min和46.9min；选定m/z255、m/z475、m/z285分别进行大豆苷元DE、乙酰染料木苷AG和黄豆黄素GLE的采集并分别控制采集时间为51.6min、52.3min和53.0min；选定m/z271进行染料木素GE的采集并控制采集时间为62.9min，继而获得被分析样本的提取离子流图，即为大豆异黄酮靶向代谢图谱。其中，典型的大豆异黄酮靶向代谢图谱如图1所示，其中有十二个峰，分别代表十二种大豆异黄酮，可以根据峰的面积统计得到每种大豆异黄酮的绝对含量。但是，由于本示例中大豆种子样本的数量较多，在此不一一进行图示展示。3)靶向代谢物定量分析：分别精确称量1.0mg大豆异黄酮标准品，溶于20μLDMSO，以色谱纯乙腈定容至10ml(C＝100μg/ml)；平衡20min后，以色谱纯乙腈稀释为75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、4μg/ml浓度的梯度标准溶液；按上述色谱、质谱条件由低到高进样，记录各种大豆异黄酮含量的标准曲线。然后，根据各大豆种子样本对应的大豆异黄酮靶向代谢图谱中各种大豆异黄酮的峰面积参数并对照各种大豆异黄酮含量的标准曲线进行回归分析，计算得到各种大豆异黄酮的绝对含量。4)分别采集获得8个大豆样本的12种异黄酮含量数据，形成一个8×12的数据矩阵，将数据矩阵中的变量进行标度化后导入SIMCA-P软件(V13.0，UmetricsAB，Umea，Sweden)，利用正交偏最小二乘-判别分析(O2PLS-DA)方法对数据矩阵进行模式识别多变量分析，所建模型具有2个主成分，根据每个样本在主成分上的投影，得到得分矩阵图，具体如图3A所示。从图3A可知，2种弱耐荫大豆、4种中度耐荫大豆和2种高耐荫大豆样本的投影在得分矩阵图上可以得到很好的分离，表明不同耐荫特性的大豆存在明显的区别。根据每个变量在主成分上的投影，可以得到载荷矩阵图，具体如图3B所示。其中，与得分矩阵对应的载荷矩阵图反映出导致样本对组间分开作出了贡献的差异代谢物，从图3B可知，化合物DE、GE、GLE、GLG、AGL、MGL离中心点较远，对区分样本所做贡献大。将上述6个化合物在典型的强耐荫材料(ND12、14011)与弱耐荫材料(14059、14055)的变量信息导入到SPSS，两者间做样本t检验，通过t检验的变量(p<0.05)认为是对不同抗逆潜力大豆种质资源的代谢有显著性差异的化合物，并结合各大豆实际耐荫表型(加权敏感指数越小，越耐荫)(如表3所示)，对上述判别分类进行验证，可发现E型异黄酮苷元含量高(大豆苷元、黄豆黄素、染料木素)的大豆具有更大的苗期耐荫特性。当某大豆材料的E型异黄酮苷元含量高于90μg/g时，其具有较好的耐荫潜力，可作为耐荫型重点育种基础材料加以利用。表4示例2中8种不同耐荫特性大豆的12种异黄酮含量信息本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。