检测水产品中四溴双酚A、十溴联苯醚和六溴环十二烷三类溴系阻燃剂含量的方法与流程

本发明涉及食品安全检测领域，尤其指一种检测水产品中四溴双酚A、十溴联苯醚和六溴环十二烷三类溴系阻燃剂含量的方法。

背景技术：

作为食品家族的重要一员，水产品以其低脂肪、高蛋白、营养丰富、味道鲜美等优点正成为国内外消费者的首选食品之一，目前我国居民人均水产品消费处于副食品消费的核心地位。同时水产品也是我国重要的出口货物，为出口创汇贡献了重要力量。因此，水产品质量安全对于保障人民身体健康和生命安全、促进水产品对外贸易具有十分重要的意义。溴代阻燃剂(Brominated flame retardants)是世界上消费量最大的卤素有机阻燃剂，目前正在使用的溴代阻燃剂约75种，其中最主要的是多溴联苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)、四溴双酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBP-A)和六溴环十二烷(Hexabromocyclododecane，HBCDs)，主要应用于建材、印刷电路板、塑料、涂层、电线电缆及聚氨酯泡沫中。这些物质会缓慢地从含有阻燃剂的产品中释放出来。有文献报道阻燃剂残留已广泛存在于土壤、沉积物、室内灰尘、水体、海洋生物、鸟类以及人体血液、乳液、体液和脂肪中，并具有很强的累积性、持久性、神经毒性及内分泌干扰特性。由于传统溴代阻燃剂的巨大毒性，已纷纷被各国所禁止或限制生产与使用，其中商业五溴和八溴二苯醚已于2009年被列入控制持久性有机污染物的《斯德哥尔摩公约》，HBCDs也于2013年被列入该条约。英国和日本已将HBCDs列为优先控制的化学品，挪威已完成国家评估并将HBCDs列入了国家禁止使用的化学物质。而HBCDs是一种类似于持久性有机污染物潜在环境内分泌干扰物，它能在环境和生物体内累积，对环境和生物体产生严重影响，已有研究表明HBCDs对藻类、软体动物、甲壳动物和鱼体有明显的毒性作用。

近年来，由于多溴联苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)、四溴双酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBP-A)和六溴环十二烷(Hexabromocyclododecane，HBCDs)的使用量大、残留期长、在环境中的检出率高，且具有生物毒性，已经受到国际社会广泛关注。目前多溴联苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)、四溴双酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBP-A)和六溴环十二烷(Hexabromocyclododecane，HBCDs)的生产厂家集中在山东、河北和江苏等省份，国内总需求量正在不断增长，但是目前国内有关多溴联苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)、四溴双酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBP-A)和六溴环十二烷(Hexabromocyclododecane，HBCDs)环境问题的研究工作才刚刚起步，至今没有形成有组织的系统研究，特别是缺少对水环境多溴联苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)、四溴双酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBP-A)和六溴环十二烷(Hexabromocyclododecane，HBCDs)全面调查评价，同时也缺乏相应检测技术和控制策略。关于多溴联苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)、四溴双酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBP-A)和六溴环十二烷(Hexabromocyclododecane，HBCDs)检测的研究报道主要集中在水体样品和环境样品方面，涉及的方法主要包括气相色谱/质谱联用法、液相色谱/质谱联用法及高效液相色谱/串联质谱联用法等。由于HBCDs的3种主要异构体在160℃以上会发生热重排，在240℃以上将脱溴降解，从而限制了气相色谱/质谱联用法的推广应用。有关文献报道采用气相色谱-电子捕获检测(GC-ECD)、气相色谱-质谱(GCMS)来检验环境样品中痕量四溴双酚A，GC-ECD方法对溴原子固然有很好的响应，但是在选择性上尚有不足；而GC-MS具有较好的选择性，但此检测方法检出限差，而且需要繁琐的预处理以及样品的衍生化。近年来，随着高效液相色谱-质谱串联(LC-MS/MS)技术的快速发展，LC-MS/MS已成为环境中多溴联苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)、四溴双酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBP-A)和六溴环十二烷(Hexabromocyclododecane，HBCDs)测定新兴采用的方法。目前只有针对水中四溴双酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBP-A)和六溴环十二烷(Hexabromocyclododecane，HBCDs)同时测定的相关文献报道，还未见同时分析六溴环十二烷、四溴双酚A和多溴联苯醚等3类阻燃剂的相关报道。

目前，对多溴联苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)、四溴双酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBP-A)和六溴环十二烷(Hexabromocyclododecane，HBCDs)进行检测分析存在的主要困难包括：ESI电离对多溴联苯醚分析的专属性较弱，更易受到复杂基质的干扰，导致无法满足样品测定要求。而且由于有些水产品油脂高，原有的前处理方法需要大量时间。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种操作简便，检测快速准确的检测水产品中四溴双酚A、十溴联苯醚和六溴环十二烷三类溴系阻燃剂含量的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：本检测水产品中四溴双酚A、十溴联苯醚和六溴环十二烷三类溴系阻燃剂含量的方法，其特征在于：包括以下步骤，建立加速溶剂萃取-快速液相色谱-串联质谱测定水产品中四溴双酚A、十溴联苯醚和六溴环十二烷三类溴系阻燃剂含量，将需检测水产样品经C₁₈色谱柱分离，以水和甲醇为流动相进行梯度洗脱，质谱多反应监测模式检测，基质标准校正，外标法定量测定，确证。

作为改进，所述质谱多反应监测模式：利用流动注射泵连续进样，在负离子模式下进行全扫描，以选择适配的分子离子峰和电离方式。

进一步改进，所述质谱多反应监测模式，为负离子电喷雾模式；ΔEMV600V，干燥气体温度为300℃；干燥气体流量为7L/min；雾化器压力为30psi；鞘气温度为300℃；鞘气流量为10L/min；毛细管电压为2000V；喷嘴电压为1900V。

进一步改进，色谱条件：Waters ACQUITY UPLC BEH-C₁₈色谱柱，色谱柱规格为：2.1mm×100mm，1.7μm；色谱柱控制为40℃；进样量为10μL；流速为0.3mL/min；流动相A为水，流动相B为甲醇。

再改进，样品预处理：

一)制样，称取约100g试样，切成小块后再用研磨机粉碎；

二)提取，称取粉碎好的1g试样于定性滤纸中，试样称处要求准确到0.01g，包好后置于萃取池中进行加速溶剂萃取，萃取剂为丙酮-正己烷溶液，样品池温度120℃，压力10.3MPa，加热时间5min，静态萃取时间10min，氮气吹扫时间100秒，循环次数为3次，冲洗样品池的体积为20％，萃取结束后，萃取液在40℃以下减压浓缩至近干，用正己烷定容至3mL，待净化；

三)净化，将C₁₈色谱柱依次用2mL二氯甲烷和2mL甲醇活化后，将试样溶液过柱，先用12mL正己烷淋洗，再用5mL甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干后加入甲醇与水混合比为1∶1的溶液定容至1mL，搅拌均匀，经0.22μm针头过滤器过滤，供快速液相色谱-串联质谱测定。

作为改进，所述加速溶剂萃取，根据检测样品的物理性质，通过加入浓度为100μg/kg溶液回收实验，并选择丙酮和正己烷为提取溶剂，丙酮与正己烷的混合体积比为＝1∶1。

作为改进，标准溶液的配置：用电子天平分别准确称取四溴双酚A、十溴联苯醚、六溴环十二烷，所述六溴环十二烷于100mL容量瓶中，以1∶1体积比的甲醇与水为溶剂准确配制1000μg/mL储备液，使用时用甲醇与水溶液逐级稀释至所需浓度，储备液于4℃下避光储存，所述储备液最长存放时为1个月，所述六溴环十二烷有三种异构体，分别为：α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD。

作为改进，标准曲线绘制，与精密度关系：分别量取储备液适量，用以1∶1体积比的甲醇与水的溶液稀释至浓度为1.0，2.0，5.0，10，50和100μg/L的标准工作液，自动进样10μL，进行HPLC-MS/MS分析，以水产品待测物在选择反应监测MRM模式下的峰面积Y对相应的水产品待测物质量浓度X，X的单位为μg/L)使用外标法绘制标准曲线，并将10μg/L的标准工作液，连续重复进样6次，计算峰面积的相对标准偏差，结果见下表1：从表可知，水产品待测物质量浓度为1.0～100.0μg/L时线性良好，相关系数r≥0.9988，满足定量分析的要求，

表1 5种水产品待测物的线性范围、回归方程、相关系数r和峰面积的RSD

上述的MRM指的是：质谱多反应监测，所述的HPLC-MS/MS指的是：超快速液相色谱-串联质谱，峰面积的RSD是指波形图里面波峰与X轴所包围的面积。

进一步改进，选取进入市场的22种水产品，进行随机抽样检测，如果未发现阳性样品，接着将以水产品加工品作为采集对象，扩大筛查范围；回收率、检出限与定量限的确定，根据3倍，10倍信噪比分别确定检出限，定量限，在阴性样品基质中添加5，50和100μg/kg 3个水平的混合标准溶液，按样品预处的方法进行处理，每个水平重复测定6次，得到5种目标物的回收率，检出限与定量限见下表2。目标物的检出限为1.0μg/kg和2.0μg/kg，定量限为3.0μg/kg和5.0μg/kg；且在3个不同加入标准溶液浓度的水平下5种目标物的回收率在83.6％～95.9％范围内，完全满足国内外水产品中四溴双酚A、十溴联苯醚和六溴环十二烷三类溴系阻燃剂检测的要求，

表2 水产品中5种目标物的加标回收率，RSDs，检出限和定量限

所述22种水产品为：白蟹、富贵虾、小黄鱼、大黄鱼、龙头鱼、黄姑鱼、梅童鱼、鮸鱼、玉秃、鲳鱼、带鱼、青占鱼、马鲛鱼、鳓鱼、鲭鱼、鱿鱼、乌贼、海带、海蜇、海地瓜、蛏子和文蛤。所述RSDs即指：峰面积的RSD是指波形图里面波峰与X轴所包围的面积。

现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的检测方法操作简便，检测快速准确，针对三类溴系阻燃剂，通过比较加速溶剂萃取与液液萃取的优缺点，优化试验方案，建立合适的提取方法，并保证方法简单快捷并具有出色的通用性。对加速溶剂萃取的参数进行考察与优化，考察压力，萃取时间，温度，样品量与解析时间对三类溴系阻燃剂萃取效率的影响，取得最佳萃取条件；根据三类溴系阻燃剂的性质，确定最佳的样品净化条件，进而建立起分辨率好、灵敏度高的分析方法，以保障测试结果的准确性和稳定性，降低对仪器和色谱柱的损害和污染；优化检测方法，通过重现性、线性、加标回收等试验，确定方法回收率，方法最小检出限、方法稳定性、灵敏度、校准曲线线性范围等方法技术指标，满足分析要求；通过优化液相及质谱各种参数和条件，实现三类溴系阻燃剂的快速分离和准确定量，形成高通量检测方法；集成共性技术，提取和净化高效，分离度好、定量准确；基质简单，避免三类溴系阻燃剂受到复杂基质的干扰，在提取过程中避免待测组分的损失；采用先进的加速溶剂萃取-液相色谱-质谱联用技术，建立可以同时检测水产品中三类溴系阻燃剂的方法，进而健全三类溴系阻燃剂检验鉴定技术和方法标准体系。本发明不仅对保障消费者身体健康和生命安全，促进水产品加工业持续健康发展有巨大的现实意义，也可为食品行业监管部门和检测机构提供有利的技术储备，应用前景广。

附图说明

图1与图2是本发明实施例中20μg/L TBBPA标准溶液的MRM谱图；

图3与图4是本发明实施例中20μg/L α-HBCD，β-HBCD，γ-HBCD标准溶液的MRM谱图；

图5与图6是本发明实施例中20μg/L BDE209标准溶液的MRM谱图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

本检测水产品中四溴双酚A、十溴联苯醚和六溴环十二烷三类溴系阻燃剂含量的方法，包括以下步骤，建立加速溶剂萃取-快速液相色谱-串联质谱测定水产品中四溴双酚A、十溴联苯醚和六溴环十二烷三类溴系阻燃剂含量，将需检测水产样品经C₁₈色谱柱分离，以水和甲醇为流动相进行梯度洗脱，质谱多反应监测模式检测，基质标准校正，外标法定量测定，确证。所述质谱多反应监测模式：利用流动注射泵连续进样，在负离子模式下进行全扫描，以选择适配的分子离子峰和电离方式。所述质谱多反应监测模式，为负离子电喷雾模式；ΔEMV600V，干燥气体温度为300℃；干燥气体流量为7L/min；雾化器压力为30psi；鞘气温度为300℃；鞘气流量为10L/min；毛细管电压为2000V；喷嘴电压为1900V。色谱条件：Waters ACQUITY UPLC BEH-C₁₈色谱柱，色谱柱规格为：2.1mm×100mm，1.7μm；色谱柱控制为40℃；进样量为10μL；流速为0.3mL/min；流动相A为水，流动相B为甲醇。

样品预处理：

一)制样，称取约100g试样，切成小块后再用研磨机粉碎；

二)提取，称取粉碎好的1g试样于定性滤纸中，试样称处要求准确到0.01g，包好后置于萃取池中进行加速溶剂萃取，萃取剂为丙酮-正己烷溶液，样品池温度120℃，压力10.3MPa，加热时间5min，静态萃取时间10min，氮气吹扫时间100秒，循环次数为3次，冲洗样品池的体积为20％，萃取结束后，萃取液在40℃以下减压浓缩至近干，用正己烷定容至3mL，待净化；

三)净化，将C₁₈色谱柱依次用2mL二氯甲烷和2mL甲醇活化后，将试样溶液过柱，先用12mL正己烷淋洗，再用5mL甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干后加入甲醇与水混合比为1∶1的溶液定容至1mL，搅拌均匀，经0.22μm针头过滤器过滤，供快速液相色谱-串联质谱测定。

加速溶剂萃取，根据检测样品的物理性质，通过加入浓度为100μg/kg溶液回收实验，并选择丙酮和正己烷为提取溶剂，丙酮与正己烷的混合体积比为＝1∶1。

标准溶液的配置：用电子天平分别准确称取四溴双酚A、十溴联苯醚、六溴环十二烷，所述六溴环十二烷于100mL容量瓶中，以1∶1体积比的甲醇与水为溶剂准确配制1000μg/mL储备液，使用时用甲醇与水溶液逐级稀释至所需浓度，储备液于4℃下避光储存，所述储备液最长存放时为1个月，所述六溴环十二烷有三种异构体，分别为：α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD。

标准曲线绘制，与精密度关系：分别量取储备液适量，用以1∶1体积比的甲醇与水的溶液稀释至浓度为1.0，2.0，5.0，10，50和100μg/L的标准工作液，自动进样10μL，进行HPLC-MS/MS分析，以水产品待测物在选择反应监测MRM模式下的峰面积Y对相应的水产品待测物质量浓度X，X的单位为μg/L)使用外标法绘制标准曲线，并将10μg/L的标准工作液，连续重复进样6次，计算峰面积的相对标准偏差，结果见下表1：从表可知，水产品待测物质量浓度为1.0～100.0μg/L时线性良好，相关系数r≥0.9988，满足定量分析的要求，

表1 5种水产品待测物的线性范围、回归方程、相关系数r和峰面积的RSD

上述的MRM指的是：质谱多反应监测，所述的HPLC-MS/MS指的是：超快速液相色谱-串联质谱，峰面积的RSD是指波形图里面波峰与X轴所包围的面积。

选取进入市场的22种水产品，进行随机抽样检测，如果未发现阳性样品，接着将以水产品加工品作为采集对象，扩大筛查范围；回收率、检出限与定量限的确定，根据3倍，10倍信噪比分别确定检出限，定量限，在阴性样品基质中添加5，50和100μg/kg 3个水平的混合标准溶液，按样品预处的方法进行处理，每个水平重复测定6次，得到5种目标物的回收率，检出限与定量限见下表2。目标物的检出限为1.0μg/kg和2.0μg/kg，定量限为3.0μg/kg和5.0μg/kg；且在3个不同加入标准溶液浓度的水平下5种目标物的回收率在83.6％～95.9％范围内，完全满足国内外水产品中四溴双酚A、十溴联苯醚和六溴环十二烷三类溴系阻燃剂检测的要求，

表2 水产品中5种目标物的加标回收率，RSDs，检出限和定量限

所述22种水产品为：白蟹、富贵虾、小黄鱼、大黄鱼、龙头鱼、黄姑鱼、梅童鱼、鮸鱼、玉秃、鲳鱼、带鱼、青占鱼、马鲛鱼、鳓鱼、鲭鱼、鱿鱼、乌贼、海带、海蜇、海地瓜、蛏子和文蛤。所述RSDs即指：峰面积的RSD是指波形图里面波峰与X轴所包围的面积。

样品预处理方法研究：

比较加速溶剂萃取方法与传统方法的预处理效果，优化试验方案，建立合适的目标物提取方法，并保证方法的简单、快捷及通用性。并对自动顶空的参数进行考察与优化，考察压力，萃取时间，温度，样品量与解析时间对四溴双酚A、十溴联苯醚和六溴环十二烷萃取效率的影响，确认最佳萃取条件。

根据三类溴系阻燃剂的性质，比较不同的净化方式，确定最佳的样品净化条件，进而建立起分辨率好、灵敏度高的分析方法，以保障测试结果的准确性和稳定性以及降低对仪器和色谱柱的损害和污染。

检测方法优化：通过重现性、线性、加标回收等试验，确定方法回收率，方法最小检出限、方法稳定性、灵敏度、校准曲线线性范围等方法技术指标，满足分析要求。

采用液相色谱串联质谱法测定三类溴系阻燃剂，通过优化液相及质谱各种参数和条件，实现三类溴系阻燃剂的快速分离和准确定量，形成高通量检测方法。

集成共性技术，建立高效提取和净化、高通量、分离度好、定量准确的三类溴系阻燃剂的快速检测方法。

建立水产品中三类溴系阻燃剂污染状况数据库。

选取浙江沿海水产加工企业生产的典型海产加工制品，按已建立的方法进行水产品中三类溴系阻燃剂的检测与分析，建立污染状况数据库，研究影响水产品中三类溴系阻燃剂形成的主要因素，为水产品的加工、贮藏、运输及贸易过程中三类溴系阻燃剂的监控提技术支撑。

本发明实施应用成功后，可为水产品加工生产企业有效应对国际贸易技术壁垒做好技术支持和服务，极大地方便水产品加工和出口，增加企业的经济效益，每年可以增加经济收入50万元以上，年增税金10万元以上。同时，本发明还能增加检测机构的业务收入，按照每年检测200批次，每批次收费500元计算，每年该项收入为10万元。

流动相的优化

选择不同流动相进行色谱峰的分离度和灵敏度的比较和研究。因为电喷雾质谱的电离是在溶液状态电离，流动相的组成和其中的添加剂除了影响目标化合物的保留时间和峰形外，还影响离子化效率，从而影响检测灵敏度。实验在满足较好的色谱分离的同时，比较了甲醇-水和乙腈-水这两种流动相对目标化合物离子化程度的影响。结果表明，当流动相为甲醇-水时，响应值明显高于以乙腈-水为流动相时的响应值(约为2～4倍)。因此，选用甲醇-水为流动相。

除了考察流动相组成外，还比较了流动相为甲醇-水和分别在此流动相中加入一定量的醋酸铵和氨水等添加剂对目标化合物离子化效率的影响。结果表明：当加入一定量的醋酸铵或氨水后，目标化合物的响应值反而有所降低，因此，实验最终确定用甲醇-水作为流动相。

萃取条件的优化

根据目标物的物理性质，通过加标回收实验(样品中加标浓度为100μg/kg)对比萃取剂甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、正己烷以及相关混合溶液的萃取效率。结果发现，甲醇和二氯甲烷提取时，杂质含量比较高，基质干扰相对较大；乙腈的提取效率相比甲醇、二氯甲烷稍高，但与丙酮和正己烷相比，溶解性较差。最终选择丙酮和正己烷作为提取溶剂。并经过反复实验发现，丙酮∶正己烷＝1∶1(V/V)溶液的萃取率较高可达92％。

质谱条件的优化

采用多反应监测(MRM)模式，利用流动注射泵连续进样，在负离子模式下进行全扫描，以选择适当的分子离子峰和电离方式。结果表明，电喷雾负离子电离模式下，目标化合物全扫描的准分子离子[M-H]^-和[M-Br+O]^-比较稳定，[M-H]^-的离子强度比[M-Br+O]^-的离子强度大。因此实验选用目标化合物的[M-H]^-为碰撞诱导解离的母离子，对待测化合物的碰撞能量和各种电压参数进行了优化，各化合物的离子对和优化后的质谱分析参数见表2，各目标化合物的MRM谱图见图1～6。

所述Psi是一种压力单位，即1mpa＝145psi。表格中的BDE209是十溴联苯醚。

所述ΔEMV是表示：电子倍增管的电压。

所述鞘气是指：质谱中用来雾化、去溶剂气体叫鞘气，鞘气一般为氮气，起帮助流动相气化的作用。所述5种目标物是指：TBBPA、α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD、BDE209的回收率。TBBPA表示：四溴双酚A，BDE209表示：十溴联苯醚，HBCD六溴环十二烷三类溴。其中α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD是表示六溴环十二烷的三种异构体。