快速定量检测猪瘟抗体的试剂盒及其制备方法与流程

文档序号:11824524阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种快速定量检测猪瘟抗体的试剂盒,包括:

一盒体;

设置在盒体内的胶体金免疫层析试纸卡、开设在盒体上的观察窗和加样孔;

所述胶体金免疫层析试纸卡包括一底板、设置在底板上的样品垫、猪瘟抗原胶体金复合物垫、硝酸纤维素膜及吸水垫,所述硝酸纤维素膜设有由猪瘟抗原包被而成的检测带和由羊抗猪瘟抗体包被而成的对照带;

其特征在于:所述猪瘟抗原胶体金复合物垫上设有胶体金标记的猪瘟E2-E0融合表达抗原,所述胶体金标记的猪瘟E2-E0融合表达抗原是将猪瘟E2-E0融合表达抗原与一定数量的胶体金颗粒溶液通过物理吸附连接合成,所述胶体金颗粒溶液中含有的胶体金颗粒大小的均值在30~35nm。

2.根据权利要求1所述的快速定量检测猪瘟抗体的试剂盒,其特征在于:所述胶体金颗粒溶液中所含有的胶体金颗粒大小的变异度小于3%。

3.根据权利要求1或2所述的快速定量检测猪瘟抗体的试剂盒,其特征在于:所述检测带包被的猪瘟抗原为基因工程原核表达的E2-E0融合表达抗原,该抗原是通过连续梯度透析复性的可溶性抗原。

4.根据权利要求3所述的快速定量检测猪瘟抗体的试剂盒,其特征在于:所述标准曲线信息卡记录有检测带光密度值(RLU)与病毒中和试验抗体效价的对数曲线。

5.根据权利要求1所述的快速定量检测猪瘟抗体的试剂盒,其特征在于:该试剂盒内的猪瘟抗原胶体金复合物垫上设有胶体金标记的猪瘟E2-E0融合表达抗原,所述胶体金标记的猪瘟E2-E0融合表达抗原是将猪瘟E2-E0融合表达抗原与一定数量的胶体金颗粒溶液通过物理吸附连接合成,其所述胶体金颗粒溶液包括以下制备方法:

1)将浓度1%的氯金酸溶液稀释到体积比100倍的去离子水溶液中;

2)将上述氯金酸溶液放入油域加热套加热,同时匀速搅拌;

3)将上述氯金酸溶液与1%浓度柠檬酸钠按18:1000的比例混合,同时进行300rpm速度的搅拌;

4)30秒钟后搅拌速度降低至100rpm,继续加热20分钟后,水浴冷却以获得颗粒直径均值为30~35nm的胶体金颗粒溶液。

6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:在步骤2)中,所述氯金酸溶液放入油域加热套加热至90摄氏度。

7.根据权利要求5或6所述任一的制备方法,其特征在于:所述猪瘟E2-E0融合表达抗原的制备方法为:采用RT-PCR扩增E0和E2蛋白的编码基因,通过PET-32a载体将E0和E2基因串联,形成PET-E0-E2重组质粒,然后将其转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达的目的蛋白经过His亲和柱纯化,后溶解于含有8mol/ml尿素的洗脱液中,再将0.01mol/ml磷酸盐缓冲液依3ml/min的速度加入至上述透析液中,至透析液中的尿素最终浓度低于0.01mol/ml,完成复性。

8.根据权利要求7所述的制备方法,所述胶体金颗粒溶液和猪瘟E2-E0融合表达抗原通过物理吸附连接而成,其具体步骤如下:

1)用0.1mol/ml的碳酸钾溶液将胶体金颗粒溶液的PH调至7.2;

2)按照10ug/ml浓度计算所需的猪瘟E2-E0融合表达抗原,将猪瘟E2-E0融合表达抗原用去离子水稀释至0.5mg/ml,搅拌下缓慢滴入上述胶体金颗粒溶液;

3)搅拌下同样将10%的牛血清白蛋白(BSA)加入上述混合液中;

4)在离心速度12000rpm,时长40min后,将上述混合液中的上清除去,剩余的沉淀物用0.01mol/ml的PH7.2磷酸盐缓冲液复溶至原体积的1/40,得到金标复合物;

5)将上述金标复合物喷涂在玻璃纤维材质上,待干燥后制备成猪瘟抗原胶体金复合物垫。

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