3,3`‑二氨基联苯胺及其喹喔啉类似物在双乙酰检测方面的用途以及检测方法与流程

本发明涉及一种双乙酰检测方法。

背景技术：

2,3-丁二酮，又名双乙酰，常温下为浅黄色至黄绿色液体，有苯醌气味，稀溶液有奶油气味，存在于茴香油和奶油中，溶于水，能与乙醇、乙醚混溶。

双乙酰是食物中许多成分如脂肪酸(甘油三酯)、碳水化合物(糖)以及蛋白质、核酸的降解产物，作为发酵过程中的自然产物，存在于发酵乳制品及饮料中；同时，它作为一种重要的风味物质，被广泛应用于奶油味微波爆米花、糖果、巧克力、焙烤食品等的生产。但是当它的浓度超过一定范围时，就会对食物风味产生负面影响，且对人体健康具有潜在危害。大量关于双乙酰对人体健康起负面影响的研究被报道，如双乙酰可引起支气管炎，闭塞性细支气管炎，且随着吸入量及接触时间的增长不同程度地影响肺功能等。Swati等人研究证明，双乙酰可与2-脱氧鸟苷形成共价加合物，该加合物可解旋DNA，从而导致细胞凋亡。Vartak等人通过实验证明，双乙酰可大量聚集β-淀粉样肽，而有研究表明，β-淀粉样肽的聚集与阿尔兹海默症的发生有关。鉴于双乙酰的这些危害，确定其在样品中的浓度是必要的。目前，对它的分析方法研究已经引起密切关注。

双乙酰对酒类的生产过程及品质有着重要的影响。作为衡量啤酒成熟的关键指标，它在啤酒生产过程中含量逐渐降低，同时赋予啤酒特殊风味，如果含量超标则会使啤酒产生馊饭味道。国标规定，优级淡色啤酒中双乙酰含量应低于1.16μM(0.10mg/L)，仅在烈性黑啤及浓啤酒中的含量会较高。葡萄酒色泽多变，口味香醇，双乙酰低浓度时赋予葡萄酒坚果味和黄油味，但当浓度超过10mg/L时也会产生令人生厌的馊饭味道；白酒中的酮类物质有许多，其中双乙酰和3-羟基丁酮可以相互转化，量比关系在不同发酵时期不同，双乙酰有助于白酒入口喷香，在一定范围内，含量稍多可提高浓香型白酒的香气品质，质量较差的酒中含量稍有下降，不同香型的白酒中含量也有所不同。由此可见，双乙酰含量检测对酒类开发、生产和质量控制都具有重要意义。

目前，关于酒类、乳制品及饮料中双乙酰含量的检测方法有许多的报道，包括荧光分析法、紫外分光光度法、伏安法、气相色谱法、高效液相色谱法、生物传感器法以及化学发光法等等。HPLC法检测具有快速、灵敏度高、专属性好等特点，因此被广泛应用于双乙酰的含量检测中。由于双乙酰本身不具有紫外吸收，因此需采用柱前衍生-HPLC法进行检测，常见的衍生化试剂有2,4-二硝基苯肼、1,2-二氨基苯、1,2-二氨基-4,5-二甲氧基苯、1,2-二氨基-4-硝基苯等。虽然目前的检测方法已基本能够满足多种样品的检测，但是一方面随着人们对双乙酰危害性的认识的不断深入，另一方面由于人们对酒类，尤其是啤酒风味的多方面的需求，所以仍然有必要开发新的、更灵敏的方法，以达到快速、准确检测不同样品中双乙酰浓度的目的。

3,3'-二氨基联苯胺(DAB)的用途十分广泛，被大量应用于化学、生物化学、材料等研究领域。目前，在航空航天和军工发达的国家，DAB被开始重点研究并用作制备高档高分子材料的单体，主要用于合成耐热的高分子树脂和合成纤维，但其作为显色剂在分析化学领域的应用仅见于硒的光度法测定。

技术实现要素：

本发明的目的在于建立食品中双乙酰含量的高灵敏度的快速检测方法。

本发明首次提出：将DAB作为柱前衍生化试剂用于样品中双乙酰含量的准确检测，并给出以HPLC法来测定食品(尤其是酒类样品)中双乙酰含量的灵敏、快速的方法。

另外，本发明还以DAB为原料，进一步采用简单易行且安全可靠的反应制备了DAB的多种喹喔啉类似物，确立了这些喹喔啉类似物也能够作为柱前衍生化试剂用于样品中双乙酰含量的检测，甚至效果更佳。

本发明的理论研究以及实验分析结论如下：

1、以DAB作为衍生化试剂，采用柱前衍生-HPLC法检测双乙酰的含量。反应原理如下所示：

具体实现步骤如下：

(1)1-5mM 3,3'-二氨基联苯胺(DAB)水溶液0.2-1.0mL加入1.8-6.0mL待测样品中，混匀后25-50℃下反应15-30min；

(2)反应完成的样品以0.22μm滤膜过滤，滤液以HPLC检测。

DAB作为衍生化试剂检测双乙酰，反应在室温下5-10min即可进行完全，对pH值依赖性较小，与之前报道过的衍生化试剂相比，具有操作简便、快捷的优势。

2、DAB类似物II的合成及以它作为衍生化试剂，采用柱前衍生-HPLC法检测双乙酰的含量。反应原理如下所示：

3,3'-二氨基联苯胺(DAB)与邻二酮化合物A在pH 1-6的水溶液中于25-50oC反应5-30min即获得化合物II，其中3,3'-二氨基联苯胺(DAB)为0.3-1.0mmol，邻二酮化合物A为0.3-1.0mmol；其中，R为C1-C5的正构烷基。

化合物II作为衍生化试剂检测双乙酰，反应在室温下5-10min即可进行完全，对pH值依赖性较小。与DAB相比，它具有测定灵敏度更高的优势。

3、DAB类似物III的合成及以它作为衍生化试剂，采用柱前衍生-HPLC法检测双乙酰的含量。反应原理如下所示：

3,3'-二氨基联苯胺(DAB)与邻二酮化合物B在pH 1-6、5:1～1:1水-甲醇混合液(V/V)于25-50℃反应5-30min即获得化合物III，其中3,3'-二氨基联苯胺(DAB)为0.3-1.0mmol，邻二酮化合物B为0.3-1.0mmol；其中，n＝1～4。

化合物III作为衍生化试剂检测双乙酰，反应在室温下5-10min即可进行完全，对pH值依赖性较小。与DAB及II相比，它具有测定灵敏度更高的优势。

4、DAB类似物IV的合成及以它作为衍生化试剂，采用柱前衍生-HPLC法检测双乙酰的含量。反应原理如下所示：

需首先制得化合物III，然后取化合物III在甲醇或乙醇中，以0.3-1.2mmol的SeO₂为催化剂，于25-50℃反应15-30小时脱氢即得到化合物IV；其中化合物III为0.2-1.0mmol。

化合物IV作为衍生化试剂检测双乙酰，反应在室温下5-10min即可进行完全，对pH值依赖性较小。与DAB及II、III相比，它具有测定灵敏度更高的优势，且其检测波长更长。

采用以上化合物II-IV作为衍生化试剂检测双乙酰含量的方法，具体步骤如下：

(1)1-5mM化合物II-IV的20-50％甲醇溶液0.2-1.0mL加入1.8-6.0mL待测样品中，混匀后25-50℃下反应15-30min；

(2)反应完成的样品以0.22μm滤膜过滤，滤液以HPLC检测。

其中，所使用HPLC检测可以设置如下：

色谱柱：C18反相色谱柱；流动相：甲醇-水梯度洗脱，0min，60％甲醇；10min：100％甲醇；15min：60％甲醇；17min：60％甲醇；柱温：室温；进样量：30μL；流速0.7-1.0mL/min；检测波长：254-287nm。

上述C18反相色谱柱优选Shim-Pack VP-ODS C18柱，250x 4.6mm,5μm。

本发明还具有以下优点：

衍生化试剂DAB易溶于水，与双乙酰反应条件简单，室温下5-10min即可反应完成，反应对pH值依赖小，操作简便。

DAB类似物II-IV与双乙酰反应体系为含50％甲醇水溶液，与双乙酰室温下反应10min即可，操作简便。产物紫外检测灵敏度高，HPLC检测高效、快捷，检测成本低。

附图说明

图1为DAB与双乙酰反应产物的HPLC色谱图。

图2为DAB测定双乙酰工作曲线。

图3为DAB类似物III与双乙酰反应产物的HPLC色谱图。

图4为DAB类似物III测定双乙酰工作曲线。

具体实施方式

一、DAB类似物II-IV的制备

1、DAB类似物II的制备：反应如下所示，以化合物A选用双乙酰为例。

具体过程为：称取3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB-4HCl)(108mg，0.3mmol)，加入到25mL圆底烧瓶中，加入10mL蒸馏水，室温下温和搅拌使DAB充分溶解。大约10-20分钟后，加入双乙酰(35mg，0.4mmol)，室温下继续搅拌半小时后，将反应液过滤，不溶物用蒸馏水洗三次(5mL×3)，得到洗涤液与之前的滤液合并，三氯甲烷萃取(20mL×5)，合并第3次至第5次萃取液，无水MgSO₄干燥2小时后，过滤除去干燥剂，滤液经减压浓缩得到暗红色粉末(65.2mg，82.3％)。¹H-NMR(D₂O，400MHz)：7.51(1H，brs)，7.41(1H，brs)，7.15(2H，brs)，7.00(2H，m)，2.38(3H，s，Me)，2.31(3H，s，Me)。ESI-MS(正离子模式)m/z：265.17[M+H]⁺。

2、DAB类似物III的制备：反应如下所示，以化合物A选用1,2-环己二酮为例。

具体过程为：称取3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB-4HCl)(108mg，0.3mmol)，加入到25mL圆底烧瓶中，加入10mL水-甲醇混合液(1:1)，室温下温和搅拌使DAB充分溶解。大约10-20分钟后，加入1,2-环己二酮(45mg，0.4mmol)，室温下继续搅拌半小时后，将反应液过滤，不溶物用水-甲醇混合液(1:1)洗三次(5mL×3)，得到洗涤液与之前的滤液合并，减压下除去甲醇，残余水溶液以三氯甲烷萃取(15mL×5)，合并第3次至第5次萃取液，无水MgSO₄干燥2小时后，过滤除去干燥剂，滤液经减压浓缩得到暗红色粉末(65.4mg，75.2％)。¹H-NMR(D₂O，400MHz)：7.55(1H，brs)，7.42(1H，brs)，7.17(2H，brs)，6.97(2H，m)，2.47(4H，m)，2.33(4H，m)。ESI-MS(正离子模式)m/z：290.17[M+H]⁺。

3、DAB类似物IV的制备：反应如下所示。

具体过程为：称取化合物III(58mg，0.2mmol)，加入到25mL圆底烧瓶中，加入10mL苯，室温下温和搅拌使之充分溶解。大约10-20分钟后，加入预先研磨成粉状的MnO₂(45mg，0.5mmol)，回流下继续搅拌两个小时后，将反应液冷却，过滤，不溶物用甲醇洗三次(5mL×3)，得到洗涤液与之前的滤液合并，减压下除去溶剂，残余物以三氯甲烷抽提(15mL×5)，合并第3次至第5次萃取液，无水MgSO₄干燥2小时后，过滤除去干燥剂，滤液经减压浓缩得到暗红色粉末(42.4mg，74.1％)。¹H-NMR(D₂O，400MHz)：7.55(1H，brs)，7.42(1H，brs)，7.29(2H，d，J＝6Hz)，7.22(2H，d，J＝6Hz)，7.17(2H，brs)，6.97(2H，m)。ESI-MS(正离子模式)m/z：286.09[M+H]⁺。

二、DAB及其类似物II-IV作为柱前衍生化试剂HPLC法测定样品中双乙酰：

1、DAB作为衍生化试剂检测白酒样品中双乙酰含量(标准加入法)：1mM DAB水溶液0.2mL加入1.8mL待测白酒样品中(平行六份)，然后在其中三份中分别加入双乙酰标准溶液，使其达到一定终浓度，混匀后室温反应10分钟，反应液分别以0.22μm滤膜过滤，滤液以HPLC检测，以DAB-双乙酰衍生物的峰面积进行定量分析。色谱条件为：色谱柱，Shim-Pack VP-ODS C18柱(250x 4.6mm,5μm)；流动相，甲醇-水梯度洗脱，0min，60％甲醇；10min：100％甲醇；15min：60％甲醇；17min：60％甲醇；柱温，室温；进样量，30μL；流速0.7mL/min；检测波长，254nm(HPLC色谱图及工作曲线分别见图1和附图2)。衍生化反应及HPLC检测原理如下式：

表一、几种白酒中双乙酰含量检测结果：

从表中可以看出，本发明的检测结果的准确度非常高。

2、DAB类似物II-IV作为衍生化试剂检测啤酒样品中双乙酰含量(标准加入法)：1mM DAB类似物II-III的50％甲醇溶液0.2mL加入1.8mL待测啤酒样品中(平行六份)，然后在其中三份中分别加入双乙酰标准溶液，使其达到一定终浓度，混匀后室温反应10分钟，反应液以0.22μm滤膜过滤，滤液以HPLC检测，以类似物II-IV与双乙酰衍生物的峰面积进行定量分析。色谱条件为：色谱柱，Shim-Pack VP-ODS C18柱(250x 4.6mm,5μm)；流动相，甲醇-水梯度洗脱，0min，60％甲醇；10min：100％甲醇；15min：60％甲醇；17min：60％甲醇；柱温，室温；进样量，30μL；流速0.7mL/min；检测波长，254nm(HPLC色谱图及工作曲线均以类似物III为例，分别见附图3和附图4)。衍生化反应及HPLC检测原理如下式(以类似物III为例)：

表二、几种啤酒中双乙酰含量检测结果：

*百威啤酒中双乙酰以DAB类似物II为衍生化试剂进行测定；哈尔滨冰爽及雪花啤酒中双乙酰以类似物III测定；汉斯干啤及青岛啤酒中双乙酰以类似物IV测定。

从表中可以看出，本发明的检测结果的准确度非常高。