本发明涉及一种电致化学发光雌二醇传感器的制备方法。属于新型纳米功能材料与生物传感器技术领域。
背景技术：
环境雌激素是指一类进入机体后，具有干扰体内正常内分泌物质的合成、释放、运输、结合、代谢等过程，激活或抑制内分泌系统的功能，从而破坏维持机体稳定性和调控作用的化合物，环境雌激素种类繁多，包括人工合成化合物及植物天然雌激素，广泛分布于自然界中。雌二醇便是一种类固醇类合成雌激素。目前，检测雌二醇的方法主要有色谱法、质谱法等。此类方法仪器贵重、操作复杂，化验人员需要专业培训后才能进行检测。因此，研发成本低、检测快、灵敏度高、特异性强的雌二醇传感器具有重要意义。
电致化学发光传感器由于其灵敏度高、特异性好、操作简便等优点被广泛应用于临床诊断、药物分析、环境监测等领域。制备性能优越的电致化学发光传感器，其最关键技术就是发光强度及稳定性和免疫分子的有效固定及重现性等性能的提高。二氧化钛是应用最为广泛的一种光催化剂材料，由于片状二氧化钛纳米材料能够暴露更多的高指数晶面，具有更高的光催化活性，二氧化钛纳米片具有比纳米粒子更好地应用前景，对于二氧化钛纳米片的研究也备受关注。同时，二氧化钛导电性差也限制了由单一二氧化钛纳米材料构建的电致化学发光传感器的灵敏度普遍不高，不利于实际应用。但是，在半导体纳米材料上修饰或复合特殊的纳米材料，可以有效提高半导体表面的共振能量转移，产生更强的发光强度，并大大提高检测灵敏度。因此，设计、制备高效、稳定的二氧化钛纳米片及其修饰物是制备电致化学发光传感器的关键技术。
二硫化钼（化学式为MoS2）纳米材料，具有二维层状结构，是应用最广泛的固体润滑剂之一。其剥离后的片状二维纳米材料，是性能优异的半导体纳米材料，除了具有大的比表面积，可以作为催化剂和生物抗体的载体，提高负载量，同时作为助催化剂也具有优良的电子传递性能。
目前，大多数的合成手段都是分开合成后，再将催化剂与载体进行复合，过程繁琐，产率不高。因此，对于原位复合制备具有优良电致化学发光性能的二维纳米复合材料具有广泛的应用前景和重要的科学意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种制备简单、灵敏度高、检测快速、特异性强的电致化学发光传感器的制备方法，所制备的传感器，可用于雌二醇的快速、灵敏检测。基于此目的，本发明首先制备了一种新型二维纳米复合材料——二氧化钛/二硫化钼复合材料，即铜掺杂二氧化钛纳米方块原位复合二硫化钼的二维纳米复合材料Cu-TiO2/MoS2，利用该材料的良好的生物相容性和大的比表面积，负载上雌二醇抗体，在进行检测时，由于铜掺杂二氧化钛可以催化过氧化氢原位生成O2，并与底液中的K2S2O8进行电化学反应，产生电致化学发光信号，再利用抗体与抗原的特异性定量结合对电子传输能力的影响，使得电流强度降低，从而降低发光强度，最终实现了采用无标记的电致化学发光方法检测雌二醇的电致化学发光传感器的构建。
本发明采用的技术方案如下：
1. 一种基于二氧化钛/二硫化钼复合材料的雌二醇传感器的制备方法，其特征在于所述的雌二醇传感器由工作电极、二氧化钛/二硫化钼复合材料、雌二醇抗体、牛血清白蛋白组成；所述的二氧化钛/二硫化钼复合材料为铜掺杂二氧化钛纳米方块原位复合二硫化钼的二维纳米复合材料Cu-TiO2/MoS2；
其特征在于，所述的制备方法包括以下制备步骤：
a. 制备Cu-TiO2/MoS2；
b. 制备雌二醇传感器；
其中，步骤a制备Cu-TiO2/MoS2的具体步骤为：
（1）取0.6 g二硫化钼粉末和0.2 ~ 2.0 mmol铜盐共同加入到3~10 mL正丁基锂溶液中，在氮气保护和30 ~ 60 ℃下，搅拌12 ~ 48小时，得到反应后的溶液；
（2）利用非极性溶剂洗涤步骤（1）中反应后的溶液，然后在30 ~ 60 ℃下进行水浴超声处理，处理完后，再利用非极性溶剂洗涤处理后的溶液，真空干燥，得到铜插层的二硫化钼纳米材料；
（3）取10 ~ 500 mg步骤（2）制得的铜插层的二硫化钼纳米材料加入到5 mL钛酸四丁酯中，搅拌1小时后，边搅拌边缓慢加入0.5 ~ 0.8 mL氢氟酸，然后160~200 ℃下在反应釜中反应18 ~ 24小时；
（4）将步骤（3）所得的反应产物，用超纯水和无水乙醇离心洗涤三次后，50 ℃下真空干燥，即制得Cu-TiO2/MoS2；
所述的正丁基锂溶液为正丁基锂的己烷溶液，浓度为1.6 mol/L；
所述的铜盐选自下列之一：硫酸铜、氯化铜、硝酸铜、乙酸铜、有机铜化合物；
所述的非极性溶剂选自下列之一：己烷、环己烷、四氯化碳、苯、甲苯；
所述的水浴超声处理，处理时间为1小时；
步骤b制备雌二醇传感器的具体步骤为：
（1）以ITO导电玻璃为工作电极，在电极表面滴涂8~12 µL的Cu-TiO2/MoS2溶胶，室温下晾干；
（2）将步骤（1）中得到的电极用缓冲溶液PBS清洗，继续在电极表面滴涂8~12 µL 10 µg/mL的雌二醇抗体溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（3）将步骤（2）中得到的电极用PBS清洗，继续在电极表面滴涂8~12 µL 浓度为100 µg/mL的牛血清白蛋白溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（4）将步骤（3）中得到的电极用PBS清洗，在4 ℃ 冰箱中保存晾干后，即制得雌二醇传感器；
所述的Cu-TiO2/MoS2溶胶为将50 mg 的Cu-TiO2/MoS2粉末溶于10 mL超纯水中，并超声30 min后制得的水溶胶；
所述的PBS为10 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，所述的磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.4。
2. 本发明所述的制备方法所制备的雌二醇传感器的应用，其特征在于，包括如下应用步骤：
a. 标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的雌二醇标准溶液；
b. 工作电极修饰：将如权利要求1所述的制备方法所制备的雌二醇传感器为工作电极，将步骤a中配制的不同浓度的雌二醇标准溶液分别滴涂到工作电极表面，4 ℃ 冰箱中保存；
c. 工作曲线绘制：将Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，与步骤b所修饰好的工作电极组成三电极系统，连接到电致化学发光检测设备上；在电解槽中先后加入15 mL的K2S2O8溶液和100 µL 的H2O2溶液；用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压；根据所得的电致化学发光的光信号强度与雌二醇抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；空白标样的光信号强度记为D0，含有不同浓度的雌二醇标准溶液的光信号强度记为Di，响应光信号强度降低的差值为ΔD = D0-Di，ΔD 与雌二醇标准溶液的质量浓度C之间成线性关系，绘制ΔD －C 工作曲线；
d. 雌二醇的检测：用待测样品代替步骤a中的雌二醇标准溶液，按照步骤b和c中的方法进行检测，根据响应光信号强度降低的差值ΔD 和工作曲线，得到待测样品中雌二醇的含量；
所述的K2S2O8溶液由1 mol K2S2O8和1 mol KCl溶于10 L 的pH=6.5缓冲溶液中制备得到，所述的pH=6.5缓冲溶液为pH值为6.5的磷酸盐缓冲溶液；
所述的H2O2溶液为过氧化氢水溶液，所述的过氧化氢水溶液的浓度为10%。
本发明的有益成果
（1）本发明所述的雌二醇传感器制备简单，操作方便，实现了对雌二醇的快速、灵敏、高选择性检测，并且成本低，可应用于便携式检测，具有市场发展前景；
（2）本发明首次采用原位复合的方法制备了新型光催化剂Cu-TiO2/MoS2，该方法主要有三个优势：一是，由于铜在二氧化钛纳米方块上的原位生长而充分与二氧化钛纳米方块接触，利用铜的金属表面等离子体作用，有效提高了半导体基质共振能量转移能力，解决了二氧化钛纳米片虽然比表面积比较大及介孔特性适用于电致化学发光基质材料，但是电致化学发光信号不稳定的技术问题；二是，由于二硫化钼片状二维纳米材料的负载特性和二氧化钛纳米方块在其上的充分分散，极大地增大了电致化学发光强度，解决了二氧化钛纳米片导电性差和电致化学发光强度弱而不利于制备电致化学发光传感器的技术问题；三是，由于铜离子在该过程中既作为插层材料又作为反应掺杂材料，最后采用原位复合的方法实现了该复合材料的一锅制备，不但节省了时间、材料损耗，而且使得制备的铜掺杂的二氧化钛纳米方块能够更好地均匀分散到二硫化钼片状二维纳米材料上面。因此，该材料的有效制备，具有重要的科学意义和应用价值；
（3）本发明首次将Cu-TiO2/MoS2应用于电致化学发光生物传感器的制备中，显著提高了电致化学发光的强度和稳定性，大大提高了电致化学发光传感器的检测灵敏度，使得电致化学发光生物传感器实现了在实际工作中的应用；该材料的应用，也为相关生物传感器，如光电化学传感器、电化学传感器等提供了技术参考，具有广泛的潜在使用价值。
具体实施方式
实施例1 Cu-TiO2/MoS2的制备
（1）取0.6 g二硫化钼粉末和0.2 mmol铜盐共同加入到3mL正丁基锂溶液中，在氮气保护和60 ℃下，搅拌12小时，得到反应后的溶液；
（2）利用非极性溶剂洗涤步骤（1）中反应后的溶液，然后在60 ℃下进行水浴超声处理，处理完后，再利用非极性溶剂洗涤处理后的溶液，真空干燥，得到铜插层的二硫化钼纳米材料；
（3）取500 mg步骤（2）制得的铜插层的二硫化钼纳米材料加入到5 mL钛酸四丁酯中，搅拌1小时后，边搅拌边缓慢加入0.5 mL氢氟酸，然后160 ℃下在反应釜中反应18小时；
（4）将步骤（3）所得的反应产物，用超纯水和无水乙醇离心洗涤三次后，50 ℃下真空干燥，即制得Cu-TiO2/MoS2；
所述的正丁基锂溶液为正丁基锂的己烷溶液，浓度为1.6 mol/L；
所述的铜盐为硫酸铜；
所述的非极性溶剂为己烷；
所述的水浴超声处理，处理时间为1小时。
实施例2 Cu-TiO2/MoS2的制备
（1）取0.6 g二硫化钼粉末和1.0 mmol铜盐共同加入到5 mL正丁基锂溶液中，在氮气保护和30 ℃下，搅拌24小时，得到反应后的溶液；
（2）利用非极性溶剂洗涤步骤（1）中反应后的溶液，然后在30 ℃下进行水浴超声处理，处理完后，再利用非极性溶剂洗涤处理后的溶液，真空干燥，得到铜插层的二硫化钼纳米材料；
（3）取200 mg步骤（2）制得的铜插层的二硫化钼纳米材料加入到5 mL钛酸四丁酯中，搅拌1小时后，边搅拌边缓慢加入0.6 mL氢氟酸，然后180 ℃下在反应釜中反应20小时；
（4）将步骤（3）所得的反应产物，用超纯水和无水乙醇离心洗涤三次后，50 ℃下真空干燥，即制得Cu-TiO2/MoS2；
所述的正丁基锂溶液为正丁基锂的己烷溶液，浓度为1.6 mol/L；
所述的铜盐为氯化铜；
所述的非极性溶剂为四氯化碳；
所述的水浴超声处理，处理时间为1小时。
实施例3 Cu-TiO2/MoS2的制备
（1）取0.6 g二硫化钼粉末和2.0 mmol铜盐共同加入到10 mL正丁基锂溶液中，在氮气保护和50 ℃下，搅拌48小时，得到反应后的溶液；
（2）利用非极性溶剂洗涤步骤（1）中反应后的溶液，然后在50 ℃下进行水浴超声处理，处理完后，再利用非极性溶剂洗涤处理后的溶液，真空干燥，得到铜插层的二硫化钼纳米材料；
（3）取10 mg步骤（2）制得的铜插层的二硫化钼纳米材料加入到5 mL钛酸四丁酯中，搅拌1小时后，边搅拌边缓慢加入0.8 mL氢氟酸，然后200 ℃下在反应釜中反应24小时；
（4）将步骤（3）所得的反应产物，用超纯水和无水乙醇离心洗涤三次后，50 ℃下真空干燥，即制得Cu-TiO2/MoS2；
所述的正丁基锂溶液为正丁基锂的己烷溶液，浓度为1.6 mol/L；
所述的铜盐为乙酸铜；
所述的非极性溶剂为苯；
所述的水浴超声处理，处理时间为1小时。
实施例4 雌二醇传感器的制备方法
（1）将宽为1 cm、长为4 cm的ITO导电玻璃作为工作电极，在电极表面滴涂8 µL的Cu-TiO2/MoS2溶胶，室温下晾干；
（2）将步骤（1）中得到的电极用缓冲溶液PBS清洗，继续在电极表面滴涂8 µL 10 µg/mL的雌二醇抗体溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（3）将步骤（2）中得到的电极用PBS清洗，继续在电极表面滴涂8 µL 浓度为100 µg/mL的牛血清白蛋白溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（4）将步骤（3）中得到的电极用PBS清洗，4 ℃ 冰箱中保存晾干后，即制得雌二醇传感器；
所述的Cu-TiO2/MoS2溶胶为将50 mg 的Cu-TiO2/MoS2粉末溶于10 mL超纯水中，并超声30 min后制得的水溶胶；
所述的PBS为10mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，所述的磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.4。
实施例5 雌二醇传感器的制备方法
（1）将宽为1 cm、长为4 cm的ITO导电玻璃作为工作电极，在电极表面滴涂10 µL的Cu-TiO2/MoS2溶胶，室温下晾干；
（2）将步骤（1）中得到的电极用缓冲溶液PBS清洗，继续在电极表面滴涂10 µL 10 µg/mL的雌二醇抗体溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（3）将步骤（2）中得到的电极用PBS清洗，继续在电极表面滴涂10 µL 浓度为100 µg/mL的牛血清白蛋白溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（4）将步骤（3）中得到的电极用PBS清洗，在4 ℃ 冰箱中保存晾干后，即制得雌二醇传感器；
所述的Cu-TiO2/MoS2溶胶为将50 mg 的Cu-TiO2/MoS2粉末溶于10 mL超纯水中，并超声30 min后制得的水溶胶；
所述的PBS为10 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，所述的磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.4。
实施例6 雌二醇传感器的制备方法
（1）将宽为1 cm、长为4 cm的ITO导电玻璃作为工作电极，在电极表面滴涂12 µL的Cu-TiO2/MoS2溶胶，室温下晾干；
（2）将步骤（1）中得到的电极用缓冲溶液PBS清洗，继续在电极表面滴涂12 µL 10 µg/mL的雌二醇抗体溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（3）将步骤（2）中得到的电极用PBS清洗，继续在电极表面滴涂12 µL 浓度为100 µg/mL的牛血清白蛋白溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；
（4）将步骤（3）中得到的电极用PBS清洗，在4 ℃ 冰箱中保存晾干后，即制得雌二醇传感器；
所述的Cu-TiO2/MoS2溶胶为将50 mg 的Cu-TiO2/MoS2粉末溶于10 mL超纯水中，并超声30 min后制得的水溶胶；
所述的PBS为10 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，所述的磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.4。
实施例7 实施例1~6制备的雌二醇传感器，应用于雌二醇的检测，步骤如下：
（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的雌二醇标准溶液；
（2）工作电极修饰：将如权利要求1所述的制备方法所制备的雌二醇传感器为工作电极，将步骤（1）中配制的不同浓度的雌二醇标准溶液分别滴涂到工作电极表面，4 ℃ 冰箱中保存；
（3）工作曲线绘制：将饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，与步骤（2）所修饰好的工作电极组成三电极系统，连接到电致化学发光检测设备上；在电解槽中先后加入15 mL的K2S2O8溶液和100 µL 的H2O2溶液；用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压；根据所得的电致化学发光的光信号强度与雌二醇抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；空白标样的光信号强度记为D0，含有不同浓度的雌二醇标准溶液的光信号强度记为Di，响应光信号强度降低的差值为ΔD = D0-Di，ΔD 与雌二醇标准溶液的质量浓度C之间成线性关系，绘制ΔD －C 工作曲线；雌二醇的线性检测范围为：0.003~100 ng/mL，检出限为：1.1 pg/mL；
（4）雌二醇的检测：用待测样品代替步骤a中的雌二醇标准溶液，按照步骤b和c中的方法进行检测，根据响应光信号强度降低的差值ΔD 和工作曲线，得到待测样品中雌二醇的含量；
所述的K2S2O8溶液由1 mol K2S2O8和1 mol KCl溶于10 L 的pH=6.5缓冲溶液中制备得到，所述的pH=6.5缓冲溶液为pH值为6.5的磷酸盐缓冲溶液；
所述的H2O2溶液为过氧化氢水溶液，所述的过氧化氢水溶液的浓度为10%。