一种富硒花生或其制备的产品中有机硒含量测定的方法与流程

本发明涉及一种富硒花生或其制备的产品中有机硒含量测定的方法，属于食品品质分析方法领域。

背景技术：

硒(selenium)作为人体必需的微量元素之一，具有多种生物学功效，尤其是其具有增强免疫力、预防慢性病和抗癌等生理功能，备受关注。机体硒营养通过膳食摄入。而由于环境硒资源的限制(如中国有72％的地域为不同程度缺硒区)，大部分地区天然食物中的硒含量较低。通过农业措施改良，来提高作物硒含量，可以实现农产品生物富硒。如今，富硒产业在政府的支持下发展起来，富硒产品也已占据一定市场。然而在目前的富硒产业链上，大部分的富硒产品只有总硒含量的限定或标识，有机硒含量却鲜有说明。这就使得一些添加无机硒(亚硒酸钠、硒酸钠等)的产品鱼目混珠，制约产业的健康发展。

花生是大宗粮油作物，其蛋白质含量丰富，是一种较好的富硒作物。富硒花生中有机硒的测定必须要经过油脂脱除工艺，但在此过程中，必然引入加工硒损失。目前有机硒检测方法通常以硒单体化合为标样，采用加标回收率的方法以评价硒的提取率，该类方法只能实现对样品中游离态有机硒检测的评价，而不能对样品中以结合态形式存在的硒化合物进行定量，从而影响对样品中总有机硒含量的客观反映。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种富硒花生或其制备的产品中有机硒含量测定的方法，本发明能测定游离态有机硒和结合态有机硒，能测定富硒花生中有机硒的总量。

本发明提供的富硒花生或其制备的产品中有机硒含量测定的方法，包括如下步骤：

1)将待测样品与酶混合，得到混合物；

所述待测样品包括富硒花生或其制备的产品；

2)将所述混合物依次经超声波辅助提取、恒温水浴振荡后，离心分离，得到上清液和残渣；

所述残渣进行上述超声波辅助提取、恒温水浴振荡后，离心分离，得到上清液1和残渣1；

3)取所述上清液和所述上清液1分别采用HPLC-ICP-MS方法检测有机硒含量；

4)将所述上清液和所述上清液1中有机硒含量求和，即得到所述待测样品中有机硒含量。

上述的方法中，取所述残渣和所述残渣1采用微波消解和ICP-MS方法测定检测所述残渣中总硒含量；所述残渣和所述残渣1中总硒含量检测用来评价待测样品有机硒的提取效果；

根据本领域的公知常识，因为一个待测样品中有机硒和总硒的含量是固定的，如果残渣中总硒的含量低或未检出，说明本发明方法对有机硒的解析提取中不存在失误；如果残渣中总硒的含量偏高，通过本发明测定的有机硒的含量则偏低，说明采用本发明方法对有机硒的解析提取中存在失误或误差，则需要重新对待测样品进行检测。

本发明所述方法中，为了计算加标回收率，具体可在所述待测样品中加入内标物；内标物具体为硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸和甲基硒代胱氨酸中的至少一种；

所述内标物在待测样品中的添加量为0.1～20ppm，具体可为0.1～10ppm；

本发明中，所述有机硒含量的定量采用HPLC-ICP-MS方法，具体是通过标品的保留时间确定样品峰，有机硒的定量采用外标法，通过标准曲线确定的。

本发明中，所述有机硒含量指的是硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸和甲基硒代胱氨酸的含量；

所述总硒含量包括有机硒和无机硒，具体指的是样品经消解后，⁸²Se含量。

本发明中，所述富硒花生选自下述a-c中的任一种：a、天然富硒种植基地或种植得到的人工富硒花生；b、通过向土壤和/或叶面增施硒肥种植得到的人工富硒花生；c、购买于市场上明确标明富硒花生字样和/或产地的富硒花生；

上述的方法中，所述富硒花生制备的产品包括富硒花生仁、脱脂富硒花生粉、富硒花生蛋白。

上述的方法中，制备所述富硒花生制备的产品为包括如下步骤：将所述富硒花生去壳，浸泡、脱衣、干燥，得到富硒花生仁；将所述富硒花生仁进行预粉碎后，依次采用超高压辅助浸提脱脂、二次恒温水浴浸提、溶剂脱溶，得到脱脂富硒花生粉；将脱脂富硒花生粉进行碱提、酸沉淀、干燥、粉碎，得到富硒花生蛋白。

上述的方法中，所述酶包括蛋白酶和脂肪酶；

所述蛋白酶的用量为0.7～3U：mg富硒花生或其制备的产品，具体可为所述蛋白酶0.7：mg富硒花生或其制备的产品；

所述脂肪酶的用量为5～20U：mg富硒花生或其制备的产品，具体可为所述脂肪酶5U：mg富硒花生或其制备的产品。

本发明中，所述蛋白酶的1个酶活力单位指的是在37℃、pH值为7.5时，在1分钟内能转化1微摩尔的酪氨酸所需的酶量；

所述脂肪酶的1个酶活力单位指的是在40℃、pH值为5.6时，在1分钟内能转化出1微摩尔的游离脂肪酸所需的酶量(月桂酸乙烯酯作为底物)。

上述的方法中，步骤1)中，采用硫代硫酸钠溶液溶解所述待测样品，

所述硫代硫酸钠溶液的浓度可为4～8mmol/L，具体可为5mmol/L；

每g富硒花生或其制备的产品中，所述硫代硫酸钠溶液的用量可为18～25mL，具体可为每g所述富硒花生或其制备的产品中使用4mL所述硫代硫酸钠溶液。

上述的方法中，所述超声波辅助提取的功率可为400～500W，具体可为500W或450～500W；

所述超声波辅助提取的温度可为30～45℃，具体可为37℃或35～40℃；

所述超声波辅助提取的时间可为0.5～2h，具体可为1h或0.8～1.5h。

上述的方法中，所述恒温水浴振荡的温度可为30～45℃，具体可为37℃或34～40℃；

所述恒温水浴振荡的时间可为12～20h，具体可为20h或15～20h；

所述恒温水浴振荡的转速可为140～200rpm，具体可为150rpm、150～200rpm、140～150rpm或140～180rpm。

上述的方法中，所述残渣和所述残渣1中总硒含量检测用来评价待测样品中有机硒的提取效果，评价结果，加标回收率为80～120％，所述富硒小麦粉标准物有机硒百分比为50～64％，效果较好。

本发明中，液相色谱的条件具体为Agilent Zorbax RX-C8色谱柱；0.1％五氟丙酸酐，2％甲醇，pH 1.98为流动相；0.9mL/min的流速。

为了评价本发明方法的解离、提取效率，采用本发明方法用富硒小麦粉标准物质代替待测样品进行检测；因硒小麦粉标准物质中总硒含量和有机硒的含量是已知的，可以与待测样品测得的结果进行对比，以评价本发明的准确性；硒小麦粉标准物质中总硒含量为17.23±0.91μg/g，有机硒(硒代蛋氨酸)含量为27.4±2.6μg/g；经实验证明，本发明方法对待测样品中有机硒含量检测具有准确性。

本发明优点在于针对富硒产业链上产品有机硒数据信息缺乏现状，建立了一种富硒花生及产品中有机硒含量分析的方法。探索了不同的前处理对有机硒提取率的影响，优化了有机硒测定的色谱条件，确定了花生脱脂粉或蛋白粉有机硒的测定方法；同时结合花生脱脂粉或蛋白粉在制备过程中硒损失分析，实现对富硒花生原料有机硒含量确定。本发明中既能测定游离态有机硒，又能测定结合态有机硒，弥补了对单一游离硒测定的不足，实现对样品有机硒的客观定量。本发明采用蛋白酶和脂肪酶的酶提取方法，修正了现有的水提、不同缓冲液或仅蛋白酶解的方法，提高了结合态硒解离成游离态的效率；避免有机硒的氧化，提取率更高；缩短提取时间而又避免超声波时间太长带来的有机硒形态转变而影响到提取效果；较好的实现有机硒的分离和定量等，提取技术在样品的有机硒高效解离、提取和减少硒形态转变、损失方面起到了良好的修正。再之，富硒花生中有机硒的测定必须要经过油脂脱除工艺，但在此过程中，必然引入加工硒损失，现有方法无法对花生原料的有机硒定量，本发明能检测从富硒花生原料到脱脂花生的制备过程中加工中硒损失情况，实现了对富硒花生原料有机硒含量确定。

附图说明

图1为本发明实施例中有机硒标准品HPLC-ICP-MS色谱峰图。

图2为从富硒花生原料到富硒花生蛋白粉制备过程中硒的损失图(⁸²Seμg/百粒花生)。

图3为硒在花生不同部位中的分布。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，富硒小麦粉标准物质-BC210a，购买于LGC北京代理处；

蛋白酶商购于sigma公司，产品目录号为96888；脂肪酶商购于sigma公司，产品目录号为p5147。

实施例1、

1)样品的制备：富硒花生原料(总硒含量为0.513mg/kg)选自国家公益性行业(农业)专项课题(编号：201303106)资助下的山东博山种植基地；将选取的富硒花生去壳后在超纯水中浸泡5min、脱衣、干燥，得到富硒花生仁；将富硒花生仁进行预粉碎，得到富硒花生碎进行超高压辅助溶剂浸提，富硒花生粉与6号溶剂油料液比1:6g/mL，超高压处理压力为300MPa、提取时间为10min，浑浊液恒温水浴摇床6h、50℃，离心4000r/min、20min得一次浸提饼粕，饼粕进行恒温水浴浸提、离心得二次浸提饼粕，脱溶，得到富硒花生脱脂粉。

2)有机硒提取：不同条件的提取方法如表1所示。根据表2的分析，最后选取E9组的方法提取有机硒。称取样品和酶混合：称取样品(富硒花生脱脂粉、对照花生脱脂粉、富硒小麦标准物)0.2000g、蛋白酶的用量为0.7U：mg样品、脂肪酶为5U：mg样品于10mL避光离心管；于5mmol/L硫代硫酸钠溶液4mL溶液中混匀(低、中、高加标组是将硒代蛋氨酸添加于对照花生脱脂粉的硫代硫酸钠溶液，使得溶液初始硒含量分别是0.1ppb,1ppb和10ppb)；超声波辅助提取：500W、37℃、1h；恒温水浴振荡：37℃、150rpm、20h；混合物离心：8000rpm、20min、4℃，取上清液；沉淀重复溶解、超声波辅助提取、恒温水浴振荡、离心、取上清液。上述蛋白酶的1个酶活力单位指的是在37℃、pH值为7.5时，在1分钟内能转化1微摩尔的酪氨酸所需的酶量；上述脂肪酶的1个酶活力单位指的是在40℃、pH值为5.6时，在1分钟内能转化出1微摩尔的游离脂肪酸所需的酶量(月桂酸乙烯酯作为底物)。

表1有机硒不同条件下的提取方法

表2硒含量(Seμg/g)及形态硒的加标回收率

表2中，低、中、高分别代表将硒代蛋氨酸添加于对照花生脱脂粉(总硒未检出)的硫代硫酸钠溶液，使得溶液含有机硒的量(即添加量)分别是0.1ppb,1ppb和10ppb；脱脂粉代表富硒花生脱脂粉；

标准物是指富硒小麦粉标准物。

由于甲基硒代胱氨酸、硒代半胱氨酸在富硒花生样品中未检出，表中未列出。

3)含量测定：将两次所得上清液分别采用HPLC-ICP-MS方法检测，残渣总硒含量采用微波消解，ICP-MS方法测定，仪器具体条件参数如表3所示。有机硒HPLC-ICP-MS色谱峰图如图1所示，图1中从左至右的三个峰：1、SeCys₂(tret＝2.67±0.02min)；2、MeSeCys(tret＝4.58±0.02min)；3、SeMet(tret＝10.50±0.04min)。

HPLC-ICP-MS测定性能如表4所示。由上述的结果表明，富硒花生脱脂粉的有机硒主要是以硒代蛋氨酸存在，含量(以硒计)为0.73μg/g，占总硒含量的69％。

表3 HPLC-ICP-MS方法条件参数

表4 HPLC-ICP-MS分析性能

实施例2、

按照实例1的步骤，仅将步骤1)得到富硒花生脱脂粉添加去离子水，物料与水料液比1:12g/mL，用NaOH(浓度为1mol/L)调节pH至9.5，40℃恒温水浴搅拌提取1h。8)提取后的溶液进行真空抽滤，收集滤液，用HCl(浓度为1mol/L)调节pH至4.7；离心：5000r/min、15min，取沉淀；将所得沉淀进行冷冻干燥、用低温超微粉碎机进行超微粉碎，过150目筛，得到富硒花生蛋白。结果表明，富硒花生蛋白粉的蛋白含量为91％，通过实施例1中3)含量测定的方法检测，得到其有机硒主要是以硒代蛋氨酸存在，含量(以硒计)为0.80μg/g，占总硒含量的76％。

实施例3、

按照实例1的步骤，仅增加步骤4)测定富硒花生原料到富硒花生蛋白粉制备过程中硒的损失，如图2所示，结合图3中结果表明，花生中的硒主要是分布在脱脂粉中，花生油不含硒，花生衣中含有一定量的硒，但是花生衣所占质量小(低于1％)，且主要成分是纤维、糖苷等；所以去除花生衣和花生油的步骤中硒损失不涉及硒代蛋氨酸损失；干燥、破碎过程属于热加工，会导致硒代蛋氨酸的形态转变，引起挥发损失，故将干燥和破碎环节的硒损失作为硒代氨基酸损失。每百粒富硒花生原料的硒含量128μg，其中硒代蛋氨酸(以硒计)为83μg，则占总硒含量的65％。