一种基于气相色谱质谱的烟草花瓣代谢组学分析方法与流程

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种基于气相色谱质谱的烟草花瓣代谢组学分析方法。

背景技术：

代谢组学是对生物系统因病理生理刺激以及基因、环境等改变所致动态多参数代谢应答的定性定量研究。代谢组学是近年来迅速发展的一个研究领域，从1997年提出代谢组学的概念以来，在植物、动物和微生物研究领域取得了卓有成效的成绩，尤其在植物代谢组学研究方面许多国内外知名大学和研究单位都开展了相关研究工作。

代谢组学研究所采用的分析方法主要有核磁共振光谱法、液相色谱质谱法、气相色谱质谱法等。到目前为止，气相色谱质谱由于其操作成本低、定性定量能力强以及对代谢物的覆盖面广等特点，已经成为植物代谢组学研究最重要的分析方法之一。

烟草是植物生物学研究非常重要的一种模式植物，也是非常重要的一种经济植物。目前，人们已在烟草品质、抗病、抗虫等方面开展了大量的研究，这些研究主要是从基因、环境等方面展开，而从代谢组学的角度开展研究的相关报道却较少。这主要是因为代谢组学目前仍是一种不断完善和发展的研究方法。由于烟叶是烟草的主要经济器官，人们对于烟草的研究主要集中在烟叶上。烟草花是烟草的生殖器官，与烟草杂交育种直接相关，是不同品种烟草间杂交亲和性研究的直接对象。因此建立烟草花的代谢组学研究方法具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于气相色谱质谱的烟草花瓣代谢组学分析方法。

本发明的目的是这样实现的，包括样品前处理、色谱质谱分离、代谢物结构鉴定、代谢物的定量分析、数据分析步骤，具体包括：

A、样品前处理：将新鲜的烟草花瓣样品剪成小块置入研钵，加液氮冷冻，研磨，冷冻干燥后得到冻干烟草花瓣样本，于4℃进行保存；

B、色谱质谱分离：

1）极性代谢物的提取及衍生化：准确称取20.0 mg的冻干烟草花瓣样本于1.5 mL离心管，加入370 μL甲醇、480 μL去离子水、450 μL甲基叔丁基醚和200 μL内标溶液，超声，离心，取下清液600 μL，放入冻干机离心浓缩2小时以去掉溶剂，取出样品加入100 μL甲氧胺溶液，37 ℃恒温肟化90 min，加入80 μL MSTFA，37 ℃恒温硅烷化30 min，衍生完的样品转至气相色谱质谱仪分析，进样量 1 μL；

2）非极性代谢物的提取：准确称取100.0 mg冻干烟草花瓣样本，加入4.9 mL二氯甲烷和100 μL内标溶液，超声30 min，离心，取上清液2 mL氮气吹干，加入200 μL二氯甲烷复溶，复溶后提取液转至气相色谱质谱仪分析，进样量 1 μL；

C、代谢物结构鉴定：采用质谱去卷积和谱图库检索、保留指数、标准化合物验证相结合的方法进行化合物定性；

D、代谢物的定量分析：将代谢物的峰面积与内标物的峰面积相除，获得相对定量信息，具体计算公式如下：

其中，C_x和C₁分别代表代谢物x和内标的含量，μg/g；

A_x和A₁分别代表代谢物x和内容的色谱峰面积；

E、数据分析：将每个分析样本中极性代谢物和非极性代谢物的定量分析结果进行统计，采用主成分分析和聚类分析作为多变量分析方法，进行样本之间的相对关系研究，采用T检验作为单变量统计分析方法，寻找关键代谢物。

本发明采用极性溶剂和非极性溶剂分别萃取烟草花瓣极性代谢物和非极性代谢物，采用保留指数和质谱谱图库定性鉴定气相色谱质谱所采集的所有代谢物，采用非靶标定量分析方法定量分析所采集的所有代谢物。该方法的建立为开展烟草花瓣代谢组学相关研究提供了重要的参考。

附图说明

图1为rustica和云烟97花瓣的主成分分析得分图（左）和载荷图（右）；

图2为rustica和云烟97花瓣代谢物无监督聚类分析图；

图3为rustica和云烟97花瓣代谢物的T检验结果火山图；

图4为烟草花瓣极性代谢物的气相色谱质谱分析总离子流图；

图5为烟草花瓣非极性代谢物的气相色谱质谱分析总离子流图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的基于气相色谱质谱的烟草花瓣代谢组学分析方法，包括样品前处理、色谱质谱分离、代谢物结构鉴定、代谢物的定量分析、数据分析步骤，具体包括：

A、样品前处理：将新鲜的烟草花瓣样品剪成小块置入研钵，加液氮冷冻，研磨，冷冻干燥后得到冻干烟草花瓣样本，于4℃进行保存；

B、色谱质谱分离：

1）极性代谢物的提取及衍生化：准确称取20.0 mg的冻干烟草花瓣样本于1.5 mL离心管，加入370 μL甲醇、480 μL去离子水、450 μL甲基叔丁基醚和200 μL内标溶液，超声，离心，取下清液600 μL，放入冻干机离心浓缩2小时以去掉溶剂，取出样品加入100 μL甲氧胺溶液，37 ℃恒温肟化90 min，加入80 μL MSTFA，37 ℃恒温硅烷化30 min，衍生完的样品转至气相色谱质谱仪分析，进样量 1 μL；

2）非极性代谢物的提取：准确称取100.0 mg冻干烟草花瓣样本，加入4.9 mL二氯甲烷和100 μL内标溶液，超声30 min，离心，取上清液2 mL氮气吹干，加入200 μL二氯甲烷复溶，复溶后提取液转至气相色谱质谱仪分析，进样量 1 μL；

C、代谢物结构鉴定：采用质谱去卷积和谱图库检索、保留指数、标准化合物验证相结合的方法进行化合物定性；

D、代谢物的定量分析：将代谢物的峰面积与内标物的峰面积相除，获得相对定量信息，具体计算公式如下：

其中，C_x和C₁分别代表代谢物x和内标的含量，μg/g；

A_x和A₁分别代表代谢物x和内容的色谱峰面积；

E、数据分析：将每个分析样本中极性代谢物和非极性代谢物的定量分析结果进行统计，采用主成分分析和聚类分析作为多变量分析方法，进行样本之间的相对关系研究，采用T检验作为单变量统计分析方法，寻找关键代谢物。

A步骤中研磨后的样品粒径为小于40目。

A步骤中冷冻干燥的真空度为0.18 mbar，温度为-6℃。

B步骤1）中所述的内标溶液为100 μg/mL的对羟基香豆酸水溶液。

B步骤1）中超声的频率为25 ~ 45 kHz，时间为20~30 min。

B步骤1）中离心的离心力≥5000g。

B步骤1）中冻干机离心浓缩的真空度为0.18 mbar，温度为-6℃。

B步骤1）中所述的甲氧胺溶液的浓度为20 mg/ml。

B步骤2）中所述的内标溶液为100 μg/mL的桃醛的二氯甲烷溶液；所述的离心的离心力≥10000g。

B步骤中色谱分析条件为：色谱柱为DB-5MS (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，程序升温条件为60℃保持1 min，5 ℃/min 升至280 ℃，保持15 min；进样口温度为250 ℃；进样体积为1 μL；载气为氦气；柱流量为1.1 mL/min；分流比为20:1；质谱分析条件为：传输线温度为230 ℃；离子源温度210 ℃；非极性代谢物的溶剂延迟时间为2 min，极性衍生化样品的溶剂延迟时间为7 min；质量扫描范围为m/z 35-400；质谱扫描速度为5 Hz。

下面以盛开期烟草花瓣为例进行分析，具体为：

1、样品前处理

1.1 实验试剂及装置

甲醇（色谱级）购买于德国Merck公司；超纯水由Millipore纯化系统制备。对羟基香豆酸和桃醛（内标化合物）购买于百灵威公司；0^#轻质柴油（用于保留指数计算）购自当地加油站。PE Clarus 600 GC-MS气相色谱质谱仪（美国PE公司）；SB-50D超声波提取仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；DB-5 MS 毛细管色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）(美国Agilent公司)；MILLI-Q纯水机（MILLIPORE公司）；LD5-2A离心机（北京京立离心机有限公司）；CP2245分析天平（感量0.0001g，德国Sartorious公司）。

1.2 样品前处理

样品制备：将新鲜的烟草花瓣样品剪成小块放入研钵，加液氮冷冻，并迅速研磨粉碎（小于40目）。磨好样品迅速转入冻干机进行冷冻干燥（真空度0.18 mbar，温度-6℃，冻干时间72 h），除去水分，置于4℃冰箱保存。

样品提取及衍生化：将烟草花瓣中代谢物分为极性代谢物和非极性代谢物。其中极性代谢物的提取和衍生化方法为：准确称取20.0 mg的冻干烟草花瓣样本于1.5 mL离心管，加入370 μL甲醇、480 μL去离子水、450 μL甲基叔丁基醚和200 μL内标溶液（对羟基香豆酸水溶液100 μg/mL），超声30 min，离心（离心力≥5000g），取下清液600 μL，放入冻干机（真空度0.18 mbar，温度-6℃）离心浓缩2小时以去掉溶剂，取出样品加入100 μL甲氧胺溶液(20 mg/mL，吡啶溶液)，37 ℃恒温肟化90 min，加入80 μL MSTFA，37 ℃恒温硅烷化30 min，衍生完的样品转至气相色谱质谱仪分析，进样量 1 μL。

非极性代谢物的提取方法：准确称取100.0 mg冻干烟草花瓣样本，加入4.9 mL二氯甲烷和100 μL内标溶液（桃醛的二氯甲烷溶液，100 μg/mL），超声30 min，离心（离心力≥10000g），取上清液2 mL氮气吹干，加入200 μL二氯甲烷复溶，复溶后提取液转至气相色谱质谱仪分析，进样量 1 μL。

1.3 色谱质谱分析条件

为方便极性代谢物与非极性代谢物对比，本方法中两种代谢物的色谱分离条件和质谱分析条件基本相同（除溶剂切割时间），具体的色谱质谱条件如下：

色谱分析条件：色谱柱为DB-5MS (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，程序升温条件为60℃保持1 min，5 ℃/min 升至280 ℃，保持15 min；进样口温度为250 ℃；进样体积为1 μL；载气为氦气；柱流量为1.1 mL/min；分流比为20:1。

质谱分析条件：传输线温度为230 ℃；离子源温度210 ℃；非极性代谢物的溶剂延迟时间为2 min，极性衍生化样品的溶剂延迟时间为7 min；质量扫描范围为m/z 35-400；质谱扫描速度为5 Hz。

1.4 代谢物的结构鉴定

由于代谢组学关注的是某种方法能检测到的所有代谢物的变化情况，而其中绝大多数代谢物很可能是传统的代谢物分析中未关注的，因此对未知代谢物的结构鉴定是代谢组学十分重要的研究内容。本实验采用质谱去卷积和谱图库检索、保留指数、标准化合物验证相结合的方法进行化合物定性。

质谱去卷积和谱图库检索：由于气相色谱无法将所有代谢物彻底分离，因此气相色谱质谱分析仪得到的某一时间点的质谱图实际上可能是几种化合物的质谱图的混合。本实验采用AMDIS（V 2.7）软件进行质谱图去卷积和峰识别，获得去除了基质背景和重叠峰的纯净质谱图。采用NIST MS Search 2.0配NIST mainlib数据库、 wileyregistry8e 数据库和fiehn代谢组学数据库进行代谢物的初步结构定性。

保留指数定性：由于代谢物在相同类型气相色谱柱上的保留指数相对稳定，本实验采用保留指数进行辅助结构定性。具体方法为：将碳数连续的直链烷烃（0#柴油）按照本实验的色谱质谱方法进行分析，获得这些烷烃的保留时间，然后根据以下公式进行代谢物的保留指数计算：

其中：RI_x指保留时间在碳数为n和n+1之间的某个代谢物的保留指数；n代表直链烷烃的碳数；t_x、t_n、t_n+1分别指代谢物x、碳数为n的直链烷烃、碳数为n+1的直链烷烃等的保留时间。

标准化合物验证：对经质谱库和保留指数定性的化合物进行标准化合物验证。即对标准化合物按照本实验的色谱质谱方法进行分析，将得到的保留时间和质谱图与烟草花瓣样品中待定化合物进行比对，如果两者均能吻合，则最终确定该化合物的定性结果。

1.5 代谢物的定量分析方法

由于无法或者难以获得所有代谢物的标准化合物，以及代谢组学通常无需绝对定量，代谢物的定量分析采用相对定量的方法。即假设代谢物在检测器上的响应与内标物一致，将代谢物的峰面积与内标物的峰面积相除，获得相对定量信息。具体计算公式如下：

其中，C_x和C_I分别代表代谢物x和内标的含量，A_x和A_I分别代表代谢物x和内标的色谱峰面积。

1.6 数据分析

将每个分析样本中极性代谢物和非极性代谢物的定量分析结果整合成一个Excel数据表（峰表），峰表中某一个代谢物的定量信息被归入特定的一列（行），以便于多样本间代谢物含量的统计分析。采用主成分分析和聚类分析作为多变量分析方法，研究样本之间的相对关系研究，采用T检验作为单变量统计分析方法，寻找关键代谢物。

下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：

实施例1

——不同品种（红大和TN90）烟草花瓣代谢组学研究

实验材料：盛开期的rustica和云烟97品种烟草样本各6个，样品制备按照“样品前处理”部分所描述方法进行。

实验方法：

极性代谢物的提取和衍生化方法为：准确称取20.0 mg的冻干烟草花瓣样本于1.5 mL离心管，加入370 μL甲醇、480 μL去离子水、450 μL甲基叔丁基醚和200 μL内标溶液（对羟基香豆酸水溶液100 μg/mL），超声30 min，离心（离心力≥5000g），取下清液600 μL，放入冻干机（真空度0.18 mbar，温度-6℃）离心浓缩2小时，去掉溶剂，取出样品加入100 μL甲氧胺溶液(20 mg/mL，吡啶溶液)，37℃水浴加热90 min，加入80 μL MSTFA，37℃水浴30 min，衍生完的样品转至气相色谱质谱分析仪分析，进样量 1 μL。

非极性代谢物的提取方法：准确称取100.0 mg的冻干烟草花瓣样本，加入4.9 mL二氯甲烷和100 μL内标溶液（桃醛的二氯甲烷溶液，100 μg/mL），超声30 min，离心（离心力≥10000g），取上清液2 mL氮气吹干，加入200 μL二氯甲烷复溶，复溶后提取液转至气相色谱质谱分析仪分析，进样量 1 μL。

色谱分析条件：色谱柱为DB-5MS (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)程序升温条件为60℃保持1 min，5 ℃/min 升至280 ℃，保持15 min；进样口温度为250 ℃；进样体积为1 μL；载气为氦气；柱流量为1.1 mL/min；分流比为20:1。

质谱分析条件：传输线温度为230 ℃；离子源温度210 ℃；非极性代谢物的溶剂延迟时间为2 min，极性衍生化样品的溶剂延迟时间为7 min；质量扫描范围为m/z 35-400；质谱扫描速度为5 Hz。采用质谱去卷积和谱图库检索、保留指数、标准化合物验证相结合的方法进行化合物定性。采用内标相对定量的方法进行定量。

代谢物的结构鉴定：采用质谱去卷积和谱图库检索、保留指数、标准化合物验证相结合的方法进行化合物定性。采用AMDIS（V 2.7）软件进行质谱图去卷积和峰识别，获得去除了基质背景和重叠峰的纯净质谱图。采用NIST MS Search 2.0配NIST mainlib数据库、 wileyregistry8e 数据库和fiehn代谢组学数据库进行代谢物的初步结构定性。采用保留指数进行辅助结构定性。具体方法为：将碳数连续的直链烷烃（0#柴油）按照本实验的色谱质谱方法进行分析，获得这些烷烃的保留时间，然后根据以下公式进行代谢物的保留指数计算：

其中：RI_x指保留时间在碳数为n和n+1之间的某个代谢物的保留指数；n代表直链烷烃的碳数；t_x、t_n、t_n+1分别指代谢物x、碳数为n的直链烷烃、碳数为n+1的直链烷烃等的保留时间。

代谢物的定量分析：由于无法或者难以获得所有代谢物的标准化合物，以及代谢组学通常无需绝对定量，代谢物的定量分析采用相对定量的方法。即假设代谢物在检测器上的响应与内标物一致，将代谢物的峰面积与内标物的峰面积相除，获得相对定量信息。具体计算公式如下：

其中，Cx和CI分别代表代谢物x和内标的含量，Ax和AI分别代表代谢物x和内标的色谱峰面积。

数据分析：采用主成分分析和聚类分析作为多变量分析方法，研究样本之间的相对关系研究，采用T检验作为单变量统计分析方法，寻找关键代谢物。

实验结果：实验结果列于表1、表2、图1、图2、图3中。从图1可以看出rustica与云烟97在主成分分析得分图（图1左）的二维平面上有明显的分离，说明这两种烟草的花瓣代谢物存在着明显的差异，而具体的差异代谢物在主成分分析得分图（图1右）上得到体现。

对代谢物数据进行聚类分析（图2）发现，云烟97与rustica两个品种形成两个明显的聚类，而两个大类中个别样本间的层次关系也在图2中得到充分体现。

为了进一步找到和验证差异性代谢物，对所有代谢物进行T检验分析，将分析的到的p值和类间均值比（rustica除以云烟97）做成火山图（图3），取p值小于0.05，且均值比大于2或小于0.5的代谢物在图中用黄色标出。从火山图上可以直观看到rustica与云烟97两种烟草花瓣的显著差异性代谢物。

表1 部分花瓣代谢物的结构定性结果

表2 部分花瓣代谢物的相对定量分析峰表