一种微量马来酰肼分离方法与流程

本发明属于分离技术领域，具体涉及一种微量马来酰肼分离方法。

背景技术：

马来酰肼，化学名称为顺丁烯二酰肼（maleic hydrazide，MH），别名为抑芽丹，作为一种选择性的植物抑制剂和除草剂，被广泛应用于植物、农作物等领域中。马来酰肼存在三种互变异构体，常温（25℃）下为白色晶体，密度为1.60g/m³，该物质比较稳定，熔点在296-298℃范围内，难溶于水和一般的溶剂。马来酰肼可降低植物的光合作用，阻碍植物体内细胞分裂，从而抑制腋芽生长，如大蒜，马铃薯和烟叶腋芽的生长。有研究报道马来酰肼是一种诱变致癌剂，生物体内累积达到一定量后会对细胞产生不同程度的毒性作用。故而，MH农药残留量成为烟叶生产必需监控项目之一。从烟叶中有效提取马来酰肼农药残留量成为检测技术的重要内容。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种微量马来酰肼分离方法。

本发明的目的是这样实现的，包括前处理、萃取分离步骤，具体包括：

A、前处理：将原料经干燥、粉碎过筛备用；

B、萃取：将前处理后的原料置入萃取罐中采用超临界CO₂流体萃取得到萃取液；

C、分离：将萃取液蒸发浓缩得到萃取浓缩液，然后将萃取浓缩液中加入原料质量体积比1：1～5的甲醇，摇匀后过有机过滤膜得到萃取净化液；

D、检测：萃取净化液用高效液相色谱进行检测马来酰肼含量。

标准曲线和检测限：

准确称取100mg马来酰肼，精确至0.1mg，溶于100mL甲醇中，得到1mg/mL的马来酰肼母液，取10mL母液用甲醇定容到100mL容量瓶中。得到100μg/mL的标准溶液，分别在蒸馏瓶中加入0.1、0.5、1、2、4、8和10mL的100μg/mL马来酰肼标准溶液，然后按测定烟草样品的步骤进行处理，制备7个标准溶液，使用HPLC测定标准溶液的峰面积（见图1），并以峰面积(y)对其相应的浓度(x)作图得到工作曲线（见图2），通过回归分析得到回归方程：Y = 8.7513X-1.615，相关系数为0.99992。该方法的检出限为2.7μg/g。

本发明采用超临界二氧化碳流体和特定助剂作为萃取剂提取烟叶中微量马来酰肼，所得萃取液通过浓缩和净化处理用于高效液相色谱分析检测。本发明操作过程简单，提取率高，有机试剂用量少，其前处理快捷，回收率高，稳定性好，且不会破坏测定样品，可作为烟草及烟草制品中微量马来酰肼的专门测定方法。

附图说明

图1为马来酰肼标准溶液的色谱图；

图2为马来酰肼标准曲线示意图；

图3为实施例1萃取分离产物之HPLC色谱图；

图4为实施例2萃取分离产物之HPLC色谱图；

图5为实施例3萃取分离产物之HPLC色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的微量马来酰肼分离方法，包括前处理、萃取分离步骤，具体包括：

A、前处理：将原料经干燥、粉碎过筛备用；

B、萃取：将前处理后的原料置入萃取罐中采用超临界CO₂流体萃取得到萃取液；

C、分离：将萃取液蒸发浓缩得到萃取浓缩液，然后将萃取浓缩液中加入原料质量体积比1：1～5的甲醇，摇匀后过有机过滤膜得到萃取净化液；

D、检测：萃取净化液用高效液相色谱进行检测马来酰肼含量。

所述的原料为烟草或烟草制品。

A步骤中所述的干燥是将原料于35～45℃下干燥4～6h至含水率为2～8%。

A步骤中所述的粉碎过筛是粉碎过40～100目筛。

B步骤中所述的超临界CO₂流体萃取的条件为：温度20～80℃；压力10～35MPa；特定助剂为甲醇、异丙醇和乙腈组合的二元或三元混合物，其配比范围为甲醇：异丙醇：乙腈=a：b：c，其中a为0、1或2，b为0或1，c为0或1；CO₂的流量为10～25g/min，特定助剂的用量为CO₂流量的2～5%；萃取方式为动态萃取；萃取时间为50～100min。

C步骤中所述的蒸发浓缩是在真空度70～90KPa，温度20～45℃下采用旋转蒸发仪浓缩5～15min得到萃取浓缩液。

C步骤中所述的有机过滤膜的为0.22～0.45μm的有机过滤膜。

D步骤中所述的高效液相色谱检测条件为：色谱柱:SBC18（4.6mm×250mm,5um）；流动相：0.1moL/L乙酸铵溶液（pH=4.8）；检测波长303nm；柱温30℃；流动相流速0.7mL/min；进样量5µL，等度洗脱。

本发明所述的微量马来酰肼分离方法的具体实施如下：

萃取分离操作：

⑴将粉碎好的烟叶在40℃下烘5小时，过筛，准确称取干燥烟末5~10g备用。

⑵将称量好的烟末放入萃取罐，设定操作参数，萃取温度、萃取压力、CO₂流量，特定助剂。

⑶参数设定完毕后，打开CO₂阀门，开启CO₂泵，萃取系统开始工作。

⑷当萃取罐内状态达到设定值，同时有尾气放出时开始计时。

⑸到达萃取时间，结束萃取实验，停止系统的运行，关闭CO₂泵，关闭CO₂阀门。

⑹萃取实验结束后，逐渐降低萃取系统压力至大气压，待萃取罐温度降至30℃，打开收集罐底的排空阀，收集萃取液并计量。

⑺实验结束后清洁超临界CO₂设备，归位。

工艺参数：

超临界二氧化碳流体状态范围为：温度20~80℃，压力10~35MPa；

特定助剂为：甲醇、异丙醇和乙腈组合的二元或三元混合物，其配比范围是甲醇:异丙醇:乙腈=A:B:C，（A=0，1，2；B=0，1；C=0，1）；

萃取操作条件：

萃取温度：20~80℃

萃取压力：10~35MPa

萃取时间：50~100min

萃取方式：动态萃取

CO₂流量：10~25g/min

特定助剂用量：取CO₂流量的2~5%

烟草样本：在不含MH的烟叶粉末中均匀加入20μg/g MH标准样品，并封存一定时间让MH充分渗透于烟叶细粒中，备用。

烟叶粉末粒度：40~100目

萃取液浓度测定：

萃取液浓缩条件：在真空度70~ 90kPa，温度为20~45℃下，采用旋转蒸发仪浓缩5~15min，得到萃取浓缩液；

净化处理：将上述萃取浓缩液用甲醇定容至10~50mL，过0.22或0.45µm有机过滤膜，得到萃取净化液。

分离结果测定：

高效液相色谱检测条件为：色谱柱:SBC18（4.6mm×250mm,5um）；流动相：0.1moL/L乙酸铵溶液（pH=4.8）；检测波长303nm；柱温30℃；流动相流速0.7mL/min；进样量5µL，等度洗脱。

标准曲线和检测限：

准确称取100mg马来酰肼，精确至0.1mg，溶于100mL甲醇中，得到1mg/mL的马来酰肼母液，取10mL母液用甲醇定容到100mL容量瓶中。得到100μg/mL的标准溶液，分别在蒸馏瓶中加入0.1、0.5、1、2、4、8和10mL的100μg/mL马来酰肼标准溶液，然后按测定烟草样品的步骤进行处理，制备7个标准溶液，使用HPLC测定标准溶液的峰面积（见图1），并以峰面积(y)对其相应的浓度(x)作图得到工作曲线（见图2），通过回归分析得到回归方程：Y = 8.7513X-1.615，相关系数为0.99992。该方法的检出限为2.7μg/g。

下面以具体实施案例对本发明作进一步说明：

实施例1

准确称取10g粒径60目烟末放于萃取罐中，设置超临界CO₂流体萃取条件：萃取压力20MPa，萃取温度55℃，CO₂流量20g/min，特定助剂为甲醇:异丙醇=1:1（V:V），其用量为CO₂流量的4%。打开CO₂阀门，开启CO₂泵，启动萃取分离系统，在设定条件下动态萃取60min，结束萃取实验，停止系统的运行，关闭CO₂泵。萃取实验结束后，逐渐降低系统压力至大气压，待萃取罐温度降至30℃，打开收集罐底的排空阀收集萃取液并称重。将所得萃取液置于真空旋转蒸发仪，在0.08MPa和温度为40℃下浓缩10min，得到萃取浓缩液；将上述萃取浓缩液用甲醇定容至10mL，过0.45µm有机过滤膜，得到萃取净化液。用高效液相色谱检测萃取净化液中马来酰肼含量，检测条件为：色谱柱:SBC18（4.6mm×250mm,5um）；流动相：0.1moL/L乙酸铵溶液（pH=4.8）；检测波长303nm；柱温30℃；流动相流速0.7mL/min；进样量5µL，等度洗脱。由检测结果得MH的回收率为95.08%，RSD为4.87%。

实施例2

准确称取10g粒径80目烟末放于萃取罐中，设置超临界CO₂流体萃取条件：萃取压力25MPa，萃取温度50℃，CO₂流量25g/min，特定助剂为甲醇:异丙醇:乙腈=1:1:1（V:V:V），其用量为CO₂流量的3%。打开CO₂阀门，开启CO₂泵，启动萃取分离系统，在设定条件下动态萃取80min，结束萃取实验，停止系统的运行，关闭CO₂泵。萃取实验结束后，逐渐降低系统压力至大气压，待萃取罐温度降至30℃，打开收集罐底的排空阀收集萃取液并称重。将所得萃取液置于真空旋转蒸发仪，在0.09MPa和温度为30℃下浓缩5min，得到萃取浓缩液；将上述萃取浓缩液用甲醇定容至10mL，过0.45µm有机过滤膜，得到萃取净化液。用高效液相色谱检测萃取净化液中马来酰肼含量，检测条件为：色谱柱:SBC18（4.6mm×250mm,5um）；流动相：0.1moL/L乙酸铵溶液（pH=4.8）；检测波长303nm；柱温30℃；流动相流速0.7mL/min；进样量5µL，等度洗脱。由检测结果得MH的回收率为99.16%，RSD为2.37%。

实施例3

准确称取5g粒径80目烟末放于萃取罐中，设置超临界CO₂流体萃取条件：萃取压力20MPa，萃取温度50℃，CO₂流量15g/min，特定助剂为甲醇:异丙醇=1:1（V:V），其用量为CO₂流量的4%。打开CO₂阀门，开启CO₂泵，启动萃取分离系统，在设定条件下动态萃取60min，结束萃取实验，停止系统的运行，关闭CO₂泵。萃取实验结束后，逐渐降低系统压力至大气压，待萃取罐温度降至30℃，打开收集罐底的排空阀收集萃取液并称重。将所得萃取液置于真空旋转蒸发仪，在0.08MPa和温度为40℃下浓缩8min，得到萃取浓缩液；将上述萃取浓缩液用甲醇定容至10mL，过0.45µm有机过滤膜，得到萃取净化液。用高效液相色谱检测萃取净化液中马来酰肼含量，检测条件为：色谱柱:SBC18（4.6mm×250mm,5um）；流动相：0.1moL/L乙酸铵溶液（pH=4.8）；检测波长303nm；柱温30℃；流动相流速0.7mL/min；进样量5µL，等度洗脱。由检测结果得MH的回收率为98.08%，RSD为2.45%。