一种快速检测载脂蛋白B48R的量子点免疫层析试纸条及其制备方法与流程

本发明属于临床血液学检测，尤其涉及快速ApoB48R的免疫层析试纸条及制备方法。

背景技术：

载脂蛋白（apolipoprotein，apo）是一种血浆脂蛋白，其基本功能是运载脂类。载脂蛋白B48(ApoB48)是唯一由小肠（人）分泌的脂蛋白，其与甘油三酯结合后生成乳糜微粒（chylomicrons CMs）及其残余物。餐后脂肪经过在小肠消化、吸收后，变成细小的乳糜微粒进入血液。在血液中，含ApoB48与甘油三酯的乳糜微粒与单核细胞一起循环。在ApoB48受体（ApoB48R）的介导下，绝大部分的甘油三酯分解，而小部分甘油三酯无法分解，形成乳糜微粒，聚集于血管壁上，久而久之，使血管内壁越来越狭窄，最终形成动脉粥样硬化，可导致心血管疾病的发生。有研究表明，ApoB48受体的含量与甘油三酯的含量呈正相关，即ApoB48受体的含量越高，甘油三酯的含量也越高。也有研究表明，ApoB48受体的含量与动脉粥样硬化的形成呈正相关，即ApoB48受体的含量越高，动脉粥样硬化的程度越严重。

使用ApoB48R单克隆抗体，用ELISA方法，对餐后血清中ApoB48R水平进行了分析，表明血清中ApoB48R浓度的增加与甘油三酯的增加呈正比。研究结果表明，血清中ApoB48R浓度可反应甘油三酯的浓度。

目前，检测甘油三酯（缩写为TG）浓度的方法，主要是在县级以上医院使用全自动生化分析仪进行血脂类项目的检测。生化检测需要大型设备；通常4小时才能完成检测。在经济贫困地区，如果没有大型设备，无法完成类似的检测。

技术实现要素：

针对现有技术的问题，本发明的ApoB48R的免疫层析试纸条可在15~20分钟之内快速完成检测，并且不需要大型生化设备。特别适用于在社区服务中心等小型医院内进行检测。

本发明的目的是为解决快速检测ApoB48R。

本发明为解决上述技术问题，采用的技术方案是：

本发明的第一个方面在于，一种快速检测ApoB48R的量子点免疫层析试纸条，检测靶点为ApoB48R，采用量子点免疫层析技术以及由此技术衍生的技术。

所述的试纸条主要由支持板、NC膜（即硝酸纤维素膜）、量子点结合垫、样品垫和吸水垫组成；

所述的NC膜设置在支持板的上部，NC膜一侧的支持板上依次黏贴有结合垫和样品垫，NC膜另一侧的支持板上黏贴有吸水垫；NC膜的中部有一条含有ApoB48R多抗的检测线和一条含有二抗的质控线；

本发明的第二个方面在于，快速检测ApoB48R的免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

1）检测线的制备：采用喷金仪，用缓冲液稀释ApoB48R多克隆抗体，在NC膜中检测线位置划线，即为检测线；所述的缓冲液为经过0.45μm滤膜过滤的缓冲液，缓冲液包括磷酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液，乙酸盐缓冲液中至少一种，缓冲液浓度范围为0.01~0.05M，pH值范围为6.0~8.0，缓冲液优选为磷酸盐缓冲液，缓冲液优选浓度范围为0.01~0.02M，pH值范围优选为7.0~7.4；

质控线的制备：采用喷金仪，用缓冲液稀释IgG二抗，在NC膜上与检测线平行的位置划线，间隔4~6mm，即为质控线，所述的缓冲液为经过0.45μm滤膜过滤的缓冲液，缓冲液包括磷酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液，乙酸盐缓冲液中至少一种，缓冲液浓度范围为0.01~0.05M，pH值范围为6.0~8.0，缓冲液优选为磷酸盐缓冲液，缓冲液优选浓度范围为0.01~0.02M，pH值范围优选为7.0~7.4；

其中，步骤（1）中检测线和质控线的线宽度为1mm，两线相距3mm，位于膜的中间，距NC膜的边距6~7mm；

NC膜组装制备：在37℃下干燥2h，得到干燥的含有检测线和质控线的NC膜。

2）制备量子点结合垫

所述量子点的制备：将4~6mM氯化镉溶于100~120ml蒸馏水中，在搅拌下，加入10~15mM巯基乙酸，逐滴加入氢氧化钠溶液，将溶液pH调节至10~12。然后将溶液转移至三颈烧瓶中，加入氮气，排除空气。在搅拌下，加入不含氧的2~4mM碲氢化钠溶液，碲氢化钠溶液由2~4mM碲粉和4~8mM硼氢化钠，在0℃水中新鲜制备。在100~110℃下回流3~5h后，合成直径3~5nm的碲化镉量子点。经乙醇沉淀并纯化后，即得到的生产用量子点。

所述量子点结合垫的制备方法包括以下步骤：将上述制备的量子点溶解于0.1~0.2ml超纯水中，使其浓度为0.5~1×10^-5M。将1~3mg EDC和0.3~1mg sulfo-NHS加入其中。加入0.2~0.4mg ApoB48R单克隆抗体。在室温下孵育1h。将溶液均匀喷洒于结合垫上，37℃干燥2h，加入干燥剂真空密封后，室温保存备用。

所述检测线中的ApoB48R多克隆抗体包括兔抗鼠ApoB48R多抗、兔抗人ApoB48R多抗、羊抗鼠ApoB48R多抗、羊抗人ApoB48R多抗中至少一种，优选为兔抗鼠ApoB48R多抗；

所述质控线中的二抗包括兔抗鼠IgG二抗、羊抗鼠IgG二抗、兔抗人IgG二抗、羊抗人IgG二抗中至少一种，优选为兔抗鼠IgG二抗；

所述量子点结合垫中ApoB48R单克隆抗体包括鼠抗人ApoB48R单抗、兔抗人ApoB48R单抗、兔抗鼠ApoB48R单抗中至少一种，优选为鼠抗人ApoB48R单抗。

3）组装快速检测动脉粥样硬化或脂肪血的免疫层析试纸条：

将涂有检测线和质控线的NC膜黏贴在支持板的中部，在NC膜的一侧依次黏贴量子点结合垫以及样品垫，在NC膜的另一侧粘贴吸水垫，得到试纸板，将试纸板切割成不同宽度的试纸条。

快速检测试纸条的应用及判定：采集待检测者的血液，离心后，取10μL血清，用PBS或生理盐水将其稀释10倍，取50μL滴加于本试纸条的加样垫上。静置15~20分钟。在荧光读数仪下进行检测，在试纸条的检测线、质控线位置均出现荧光条带时，检测为阳性；仅质控线出现一条荧光条带时，为阴性结果；在试纸条的质控线未出现荧光条带时为无效结果。

本发明量子点免疫层析试纸条的有益技术效果：本发明试纸条检测ApoB48R浓度准确度高、特异性强、检测快速，在清晨抽血后，可在20分钟之内，定量完成ApoB48R含量的检测。可根据ApoB48R含量的变化，推测甘油三酯的含量。根据甘油三脂与动脉粥样硬化的相关性分析，可对心脑血管疾病进行早发现，早治疗，早康复，预期可降低心脑血管疾病的死亡率。

附图说明

图1为使用本发明的免疫层析试纸条检测血浆标本示意图。

图2为使用本发明的试纸条的检测结果示意图

具体实施方式

实施例1

一种快速检测ApoB48R的量子点的免疫层析试纸条。试纸条主要由支持板、NC膜、量子点结合垫、样品垫和吸水垫组成；所述的NC膜设置在支持板的中部，NC膜一侧的支持板上依次粘贴有量子点结合垫和样品垫，NC膜另一侧的支持板上黏贴有吸水垫；所述NC膜的中部有一条含有ApoB48R抗体的检测线和一条含有二抗的质控线。

实施例2

ApoB48R的量子点免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：

1）制备NC膜

检测线的制备：采用喷金仪，用缓冲液稀释兔抗鼠ApoB48R多克隆抗体，在NC膜中检测线位置划线，即为检测线；所述的缓冲液为经过0.45μm滤膜过滤的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液；

质控线的制备：采用喷金仪，用缓冲液稀释兔抗鼠IgG二抗，在NC膜上与检测线平行的位置划线，间隔4mm，即为质控线，所述的缓冲液为经过0.45μm滤膜过滤的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液；

NC膜组装制备：在37℃下干燥2h，使检测线和质控线干燥，得到含有检测线和质控线的NC膜。

2）制备量子点结合垫

所述量子点的制备：将5mM氯化镉溶于110ml蒸馏水中，在搅拌下，加入12mM巯基乙酸，逐滴加入氢氧化钠溶液，将溶液pH调节至11。然后将溶液转移至三颈烧瓶中，加入氮气，排除空气。在搅拌下，加入不含氧的2.5mM碲氢化钠溶液，碲氢化钠溶液由2.5mM碲粉和5mM硼氢化钠，在0℃水中新鲜制备。在100℃下回流4h后，合成直径3.5nm的碲化镉量子点。经乙醇沉淀并纯化后，即得到的生产用量子点。

量子点结合垫的制备方法包括以下步骤：将量子点溶解于0.1ml超纯水中，使其浓度为10^-5M。将1.5mg EDC和0.5mg sulfo-NHS加入其中。加入0.2ml 1mg/ml 鼠抗人ApoB48R单克隆抗体。在室温下孵育1h。将溶液均匀喷洒于结合垫上，37℃干燥2h，加入干燥剂真空密封后，室温保存备用。

3）组装快速检测ApoB48R的量子点的免疫层析试纸条

将涂有检测线和质控线的NC膜黏贴在支持板的中部，在NC膜的一侧依次黏贴量子点结合垫和样品垫，在NC膜的另一侧粘贴吸收垫，得到试纸板，将试纸板切割成不同宽度的试纸条。

实施例3

按照实施例1及实施例2的方法，制备快速检测载脂蛋白B48R的量子点免疫层析试纸条，按照下述方法使用。

1）定量标准曲线的制定

用试纸条进行检测已知浓度的ApoB48R标准品，通过荧光读数仪测得相应的荧光强度，以浓度做横坐标，以荧光强度做纵坐标，绘制标准曲线。

2）检测方法

① 精确吸取10μL血清，加入洁净的离心管中，用PBS或生理盐水将样本稀释10倍，充分混匀；

② 用移液器吸取50μL稀释后的样本，加入至样本垫上，静置15~20min，用荧光定量读数仪进行定量判定结果；

③ 设置好仪器相关参数后，将试纸条放入仓内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果。

3）临床样本检测

对20个正常人，在餐后0~7h之内的甘油三酯和ApoB48R浓度进行检测。用生化分析仪检测甘油三酯的浓度。用ELISA进行ApoB48R浓度的定量检测。再用ApoB48R量子点免疫层析试纸条进行检测，用荧光读数仪定量判定结果。

横坐标表示时间（h）；纵坐标表示浓度（μg/mL）

横坐标表示时间（h）；纵坐标表示浓度（mg/dL）

以上表明，餐后7h之内，甘油三酯浓度与apoB48R浓度的变化趋势相同，两者的变化为正相关。可通过检测ApoB48R的含量而推断甘油三酯的含量，并根据甘油三脂与动脉粥样硬化的相关性分析，可对心脑血管疾病进行早发现，早治疗，早康复，可预期降低心脑血管疾病的死亡率。

对上表的数据进行统计学分析，实验结果表明，用ELISA法测定ApoB48R浓度与用量子点免疫层析法测定ApoB48R浓度，无显著性差异（p＞0.5），用ELISA方法测定ApoB48R浓度需要2h，而用试纸条进行检测，只需15~20min，本发明试纸条检测ApoB48R浓度准确度高、特异性强、检测快速。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的研究人员能够了解本发明的内容，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。