一种谷氨酸脱氢酶检测试剂盒的制作方法

本发明涉及临床体外检测试剂技术领域，特别涉及一种谷氨酸脱氢酶检测试剂盒。

背景技术：

谷氨酸脱氢酶(gldh或gdh)是一种主要存在于细胞线粒体基质中的酶，以肝脏含量最高，其次为肾脏、胰腺、脑、小肠粘膜及心脏等器官。其测定方法主要是连续监测法。

正常人血液中gldh活性很低，参考值范围为：0～12.2u/l，在肝细胞发生坏死时进入血液，因此肝脏疾病时尤其是涉及肝细胞线粒体损害时其活性升高显著，故常用来检查线粒体的受损程度，是肝实质损害的敏感指标。乙醇中毒伴肝细胞坏死、慢性肝炎、卤烷致肝细胞中毒、缺血性肝炎时血清中gldh的活性明显升高。gldh可用于阻塞性黄疸和非阻塞性黄疸鉴别、高血清转氨酶的鉴别诊断、评价肝细胞损害的严重程度等。对于肝脏疾病的诊断，gldh敏感性优于alt（丙氨酸转氨酶）、ast（谷草转氨酶）。

谷氨酸脱氢酶在nadh的存在下催化α-酮戊二酸与氨反应生成谷氨酸、水，同时nadh被氧化，生成nad⁺，引起340nm处吸光度的下降。在340nm处检测吸光度之差，其变化程度与样本中的gldh活性成正比。该方法是一种无需预处理样本、技术和设备要求不高、精密度和特异性更高的分析方法。由于该方法不需要昂贵的设备，可以实现自动化，且可测定大量标本，因此受到临床广泛推广。但是普通的谷氨酸脱氢酶检测试剂重复性不好，从而造成准确度差浪费试剂的不良后果。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种谷氨酸脱氢酶检测试剂盒。该试剂盒与常规的试剂盒相比，重复性好，准确度高，线性范围好，有利于试剂在临床上的推广应用。

本发明是通过以下措施实现的：

一种谷氨酸脱氢酶酶检测试剂盒，其特征在于它包含试剂r1、试剂r2和校准品，其中试剂r1组成为tris缓冲液(100mmol/l)、α-酮戊二酸(10mmol/l)、叠氮化钠(0.5%（w/v）；试剂r2组成为tris缓冲液（100mmol/l）、氯化铵（100mmol/l）、还原型辅酶ⅰ（0.5mmol/l）

aeo-9（0.1%-1%（v/v））、叠氮化钠（0.5%（w/v））。

所述试剂r1和试剂r2在使用时的体积比例为r1：r2=4：1。

本发明所使用的校准品为英国朗道公司生产的复合校准品。

本发明的试剂盒在具有双试剂功能的自动生化分析仪上进行，其具体使用方法为：加入生理盐水、样本或校准品15μl，之后再加入r1试剂240μl预孵育5min后加入60μl的试剂r2，30秒后开始记录吸光度值a1，反应5min后，读取吸光度a2，并计算δa/min。

本发明的有益效果：

本发明提供的谷氨酸脱氢酶检测试剂盒，通过在试剂r2中加入aeo-9，通过分子中不同部分分别对于两相的亲和，使两相均将其看作本相的成分，分子排列在两相之间，使两相的表面相当于转入分子内部，从而降低表面张力。由于两相都将其看作本相的一个组分，就相当于两个相与表面活性剂分子都没有形成界面，就相当于通过这种方式部分的消灭了两个相的界面，就降低了表面张力和表面自由能，从而解决了试剂重复性不好这一难题，却不会对试剂的稳定性和准确度产生影响，有利于该试剂在市场中进一步的推广。

附图说明

图1实施例2准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性；

图2实施例3准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性；

图3实施例4准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性；

图4实施例1-4线性相关验证实验检测结果；

图5实施例1-4稳定性验证实验检测结果；

图6实施例1-4重复性验证实验检测结果。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步详细说明。

实施例1

市场上获得认可的一种准确度优异的谷氨酸脱氢酶试剂盒，它包括试剂r1、试剂r2、校准品。

其中试剂r1组成为：

tris缓冲液100mmol/l

α-酮戊二酸10mmol/l

叠氮化钠0.5%（w/v）

试剂r2组成为：

tris缓冲液100mmol/l

氯化铵100mmol/l

还原型辅酶ⅰ0.5mmol/l

叠氮化钠0.5%（w/v）。

本实施例描述的试剂盒，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的东芝120自动分析仪，操作如下：

加入生理盐水、样本或校准品15μl，之后再加入r1试剂240μl预孵育5min后加入60μl的试剂r2，30秒后开始记录吸光度值a1，反应5min后，读取吸光度a2，并计算δa/min。

本实施例所使用的校准品为英国朗道公司生产的复合校准品。

实施例2

一种谷氨酸脱氢酶检测试剂盒，它包括试剂r1、试剂r2、校准品。

其中试剂r1组成为：

tris缓冲液100mmol/l

α-酮戊二酸10mmol/l

叠氮化钠0.5%（w/v）

试剂r2组成为：

tris缓冲液100mmol/l

氯化铵100mmol/l

还原型辅酶ⅰ0.5mmol/l

aeo-90.1%（v/v）

叠氮化钠0.5%（w/v）

具体测定方法同实施例1。

实施例3

一种谷氨酸脱氢酶检测试剂盒，它包括试剂r1、试剂r2、校准品。

其中试剂r1组成为：

tris缓冲液100mmol/l

α-酮戊二酸10mmol/l

叠氮化钠0.5%（w/v）

试剂r2组成为：

tris缓冲液100mmol/l

氯化铵100mmol/l

还原型辅酶ⅰ0.5mmol/l

aeo-90.5%（v/v）

叠氮化钠0.5%（w/v）

具体测定方法同实施例1。

实施例4

一种谷氨酸脱氢酶检测试剂盒，它包括试剂r1、试剂r2、校准品。

其中试剂r1组成为：

tris缓冲液100mmol/l

α-酮戊二酸10mmol/l

叠氮化钠0.5%（w/v）

试剂r2组成为：

tris缓冲液100mmol/l

氯化铵100mmol/l

还原型辅酶ⅰ0.5mmol/l

aeo-91%（v/v）

叠氮化钠0.5%（w/v）

具体测定方法同实施例1。

对上述实施例1-4中制得的试剂盒分析性能进行实验验证。

准确度验证实验：

将实施例2、3、4的试剂盒作为实验组，实施例1中市场上获得认可的准确度优异的谷氨酸脱氢酶试剂盒作为对照组进行对比实验，对40个样本进行检测，检测的结果如图1-图3。

通过图1-图3的检测数据可知，实施例2、3、4检测试剂盒与对照检测试剂盒的检测结果线性相关系数r分别为0.9996、0.9995、0.9996，相关性比较好，表明本发明的试剂盒与市场上获得认可的具有优异准确度的谷氨酸脱氢酶检测试剂盒有高度一致性，证明本发明试剂盒添加的其他各种成分对其准确性不会造成影响，试剂盒依然保持较好的准确度。

线性相关性验证实验：

找到谷氨酸脱氢酶高值样本为150u/l，用生理盐水进行系列稀释，配制6个不同浓度的样本，依次为150u/l、120u/l、90u/l、60u/l、30u/l、0u/l浓度的样本，每个浓度水平各样本分别测定三次，分别取其平均值。分别利用实施例1、2、3、4的试剂进行检测。检测结果如图4。

上述检测结果显示，实施例1-4检测结果相关性均大于0.990，但实施例2、3、4的检测结果大于0.999，与实施例1相比具有更好的线性相关性，这说明本发明试剂具有更好的线性相关性。

稳定性验证实验：

在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存试剂，检测四种实施例试剂的稳定性。四种试剂每月选取同一样本测定其吸光度三次，取平均值，与新鲜的实施例1试剂检测结果进行对比，从而确定试剂的稳定时间，检测数据如图5。

实验结果显示，实施例1-实施例4试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中能有效贮存15个月稳定，说明在试剂中加入aeo-9不会影响谷氨酸脱氢酶检测试剂盒的稳定性。

重复性验证实验：

在重复性条件下，用质控血清（正常值范围内）测试四种试剂（盒），重复测试10次，计算变异系数（cv）。分别利用实施例1、2、3、4的试剂进行检测。检测结果如图6。

实验结果显示，实施例1的重复性为4.67%，而实施例2-4的重复性分别为2.64%、2.76%、2.65%，均比实施例1的重复性好，说明在试剂中加入aeo-9能够有效的提高谷氨酸脱氢酶检测试剂盒的重复性。

综合以上分析，本发明提供的谷氨酸脱氢酶检测试剂盒，在试剂r2中通过加入一定量的aeo-9能够有效的提高谷氨酸脱氢酶检测试剂盒的重复性，而对试剂的准确度和稳定性没有影响。因此，本发明提供的重复性好的谷氨酸脱氢酶检测试剂盒有利于在市场中进一步的推广使用。