一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法与流程

本发明涉及维生素检测
技术领域：
，尤其涉及一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法。
背景技术：
：维生素A(VA)是脂溶性的醇类物质，有多种分子形式，是最早被发现的维生素，其中维生素A1(VA1)主要存在于动物肝脏、血液和眼球的视网膜中，又叫视黄醇，熔点64℃，分子式C20H30O，维生素A1(视黄醇)的化学结构式如结构式(1)所示；维生素A1(VA2)主要在淡水鱼中存在，熔点只有17～19℃，分子式C20H28O，又称视黄醛。维生素A是构成视觉细胞中感受弱光的视紫红质的组成成分，人体缺乏维生素A，影响暗适应能力，如儿童发育不良、皮肤干燥、干眼病、夜盲症，老年斑等。维生素E(VitaminE)是一种脂溶性维生素，其水解产物为生育酚，是最主要的抗氧化剂之一，多溶于脂肪和乙醇等有机溶剂中，不溶于水，对热、酸稳定，对碱不稳定，对氧敏感，对热不敏感，但油炸时维生素E活性明显降低。生育酚主要有四种衍生物，按甲基位置分为α、β、γ和δ四种。与生育酚相关的化合物生育三烯酚在取代基不同时活性是一定的，但生育酚的活性会明显降低。生育酚能促进性激素分泌，使男子精子活力和数量增加；使女子雌性激素浓度增高，提高生育能力，预防流产，还可用于防治男性不育症、烧伤、冻伤、毛细血管出血、更年期综合症、美容等方面。近来还发现维生素E可抑制眼睛晶状体内的过氧化脂反应，使末梢血管扩张，改善血液循环，预防近视眼发生和发展，维生素E(α-生育酚)的化学结构式如结构式(2)所示。目前，国内外有关血清和血浆中维生素A和维生素E的测定方法报道很多，测定维生素的方法有很多种，其中常见的方法有：层析法、分光光度法、气相色谱法、液相色谱法，在众多的方法中，液相色谱法或液相串联质谱法为测定维生素的首选方法。以往方法存在前处理复杂、干扰因素多、分析时间长、灵敏度不高、定性定量不够准确的问题。技术实现要素：针对上述技术问题，本发明目的是提供一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法(液相色谱法或液相串联质谱方法)，该方法特异性强、准确度和灵敏度高、分析时间短，且能同时检测血液中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)含量。本发明采用的技术方案是：一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，采用液相色谱法进行检测，包括如下步骤：(一)将全血样本离心，取上清液得血清或血浆，备用；(二)标准溶液的标定三个以上浓度的标准品的混合标准工作液90ul分别和10ul内标工作液涡旋混混匀，制作标准曲线系列溶液；标准曲线系列溶液在检测前必须进行紫外分光光度计重新标定浓度；所述标准品为视黄醇和α-生育酚，所述内标工作液为维生素A乙酸酯醇溶液和维生E乙酸酯醇溶液；(三)样品前处理(1)精密移取步骤(二)中所述内标工作液于离心管中，加入到步骤(一)中所述血清或血浆；(2)再加入纯水或甲酸水稀释后加入乙醇、甲醇或乙腈溶液，涡旋混匀后高速离心去除蛋白；(3)再加入正己烷萃取，涡旋混匀后离心；(4)然后取上清液后常温N2吹干；(5)加复溶液，涡旋混匀，超声，高速离心，得到上清液样品待测；(四)取步骤(三)中所述上清液样品80μL放入自动进样瓶中经液相色谱法进行分析，使用荧光检测器检测，同时定量检测血液中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)的含量，所述液相色谱测定条件如下：色谱柱：ZORBAXEclipseXDB-C8，5um，2.1mm×50mm(Agilent公司)柱温：25℃；流动相：纯水-甲醇，采用等度或梯度洗脱程序；流速：1.0mL/min；进样量：5μL。本发明所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其中，步骤(四)中所述梯度洗脱程序包括：时间(min)A(V％)B(V％)0.0014860.514860.519913.09913.5114864.201486本发明所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其中，步骤(三)中所述血清、纯水、乙醇和正己烷的体积比为1：1：2：4。本发明所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其中，步骤(二)中标准溶液的标定，包括以下步骤：(a)标准储备液的配制；(b)标准校正液的配制；(c)标准工作液的配制，制备浓度分别为0.0625μg/mL、0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL和4.0μg/mL的维生素A标准工作液和浓度分别0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL和40μg/mL的维生素E标准工作液；(d)标准内标储备液的配制；(e)内标工作液的配制，所述内标工作液中维生素A乙酸酯浓度为7.5μg/mL和维生素E乙酸酯浓度为7500μg/mL。一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，采用液相色谱串联质谱进行检测，包括如下步骤：(一)将全血样本离心，取上清液得血清或血浆，备用；(二)标准溶液的标定三个以上浓度的标准品的混合标准工作液90ul分别和10ul内标工作液涡旋混混匀，制作标准曲线系列溶液；标准曲线系列溶液在检测前必须进行紫外分光光度计重新标定浓度；所述标准品为视黄醇和α-生育酚，所述内标工作液为三氘代视黄醇和六氘代α-生育酚混合液；(三)样品前处理(1)精密移取步骤(e)中所述内标工作液于离心管中，加入到步骤(一)中所述血清或血浆；(2)再加入纯水或甲酸水稀释后加入乙醇、甲醇或乙腈溶液，涡旋混匀后高速离心去除蛋白；(3)再加入正己烷萃取，涡旋混匀后离心；(4)然后取上清液后常温N2吹干；(5)加复溶液，涡旋混匀，超声，高速离心，得到上清液样品待测；(四)取步骤(三)中所述上清液样品80μL放入自动进样瓶中经液相色谱串联质谱分析，同时定量检测血液中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)的含量，所述液相色谱串联质谱测定条件如下：色谱柱：ZORBAXEclipseXDB-C8，5um，2.1mm×50mm(Agilent公司)柱温：28℃；流动相：A为含体积比为0.1％甲酸的甲醇-B为含体积比为0.1％甲酸的水，采用等度或梯度洗脱程序；流速：0.4mL/min；进样量：5μL；串联质谱条件：数据采集方式：多反应监测模式(MRM)；雾化气温度：350℃；雾化气气流：10L/min；雾化气压：28psi；毛细管电压：4000V；离子源：电喷雾离子源；正离子模式。本发明所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其中，步骤(四)中所述梯度洗脱程序包括：时间(min)A(V,％)B(V,％)0.0085150.3085150.319552.009552.0185154.008515本发明所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其中，步骤(三)中所述血浆、纯水、乙醇和正己烷的体积比为0.1：1：2：4。本发明所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其中，步骤(二)中标准溶液的标定，包括以下步骤：(a)标准储备液的配制；(b)标准校正液的配制；(c)标准工作液的配制，制备浓度分别为0.014μg/mL、0.028μg/mL、0.056μg/mL、0.113μg/mL、0.225μg/mL、0.45μg/mL和0.90μg/mL的维生素A标准工作液和浓度分别0.14μg/mL、0.28μg/mL、0.56μg/mL、1.13μg/mL、2.25μg/mL、4.50μg/mL和9.00μg/mL的维生素E标准工作液；(d)标准内标储备液的配制；(e)内标工作液的配制，所述内标工作液中三氘代视黄醇浓度为0.1125μg/mL，六氘代α-生育酚浓度为1.125μg/mL。本发明所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，其中，所述步骤(5)中所述复溶液为甲醇、乙醇或乙腈。本发明有益效果：本发明所述的同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，特异性强、准确度和灵敏度高、分析时间短，为临床上诊断血液中维生素A和维生素E的缺乏或过量提供了可靠的实验依据，为干眼病、儿童反复呼吸道感染、产前诊断及优生优育提供了可靠的临床数据。本发明所述的同时检测血液中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)含量的检测方法能够大幅度提高加样回收率，从而大大提高检测结果的准确度，消除系统误差；以维生素A乙酸酯、维生素E乙酸酯或同位素标记物为内标，使得目标化合物的识别更为准确，简单经济，定量结果准确。附图说明图1为实施例1中血清样本中维生素A和维生素E及其内标工作液的色谱图；其中，1-维生素A；2-维生素A乙酸酯；3-维生素E；4-维生素E乙酸酯；图2为实施例1中标准溶液中维生素A和维生素E及其内标工作液的色谱图；其中，1-维生素A；2-维生素A乙酸酯；3-维生素E；4-维生素E乙酸酯；图3为实施例2中血清样本中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)的选择离子流图；其中，1-维生素A；2-维生素E；图4为实施例2中血清样本中维生素A(视黄醇)的选择离子流图；图5为实施例2中血清样本中维生素A(视黄醇)的特征质谱图；图6为实施例2中血清样本中维生素A同位素内标的选择离子流图；图7为实施例2中血清样本中维生素A同位素内标的特征质谱图；图8为实施例2中血清样本中维生素E同位素内标的选择离子流图；图9为实施例2中血清样本中维生素E同位素内标的特征质谱图。图10为实施例2中血清样本中维生素E的选择离子流图；图11为实施例2中血清样本中维生素E的特征质谱图。下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。具体实施方式实施例1一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，采用液相色谱法进行检测，包括如下步骤：(一)将全血离心，离心速度为3500r/min，离心时间为10min，取上清液得血清，所述血清置于4℃-8℃冷藏避光条件下保存(24h内)至分析前备用，或置于-20℃冷冻避光条件下(避免反复冻融)保存(72h内)至分析前备用，或置于-80℃冷冻避光条件下(避免反复冻融)保存(30天内)至分析前备用；(二)标准溶液的标定六种不同浓度的标准品的混合标准工作液90ul分别和10ul混合内标工作液以1400r/min涡旋混匀30秒，充分混匀，制作标准曲线系列溶液；标准曲线系列溶液在检测前必须进行紫外分光光度计重新标定浓度；所述标准品为视黄醇和α-生育酚，所述混合内标工作液为维生素A乙酸酯醇溶液和维生E乙酸酯醇溶液，所述标准曲线系列溶液经液相色谱法分析，绘制标准曲线。(a)标准储备液的配制：精确称取视黄醇标准品10mg，置于10ml容量瓶，用乙醇溶解，并定容于10ml，得到标准储备液A，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月；精确称取α-生育酚标准品10mg，置于10ml容量瓶，用乙醇溶解，并定容于10ml，得到标准储备液B，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月。(b)标准校正液的配制：维生素A：从步骤(a)中标准储备液A吸取20μl，置5ml容量瓶中，用无水乙醇定容，混匀；用紫外分光光度计重新标定浓度，在325nm波长下测定其紫外吸光值，结合标准比吸光系数，按照公式(1)和(2)计算出标准储备液A的实际浓度值，视黄醇的1％比吸光系数为1835。整个过程避光操作。维生素E：从步骤(a)中储备液B吸取20μl，置5ml容量瓶中，用无水乙醇定容，混匀；用紫外分光光度计重新标定浓度，在294nm波长下测定其紫外吸光值，结合标准比吸光系数，按照公式(1)和(2)计算出标准储备液B的实际浓度值，维生素E的1％比吸光系数为71。整个过程避光操作。稀释倍数＝10000*5ml/20μl……………………(2)式中：CX—待标定的标准溶液的实际浓度值；g/100mLA—给定波长处测定的待标定标准溶液的吸光度平均值；E—待标定标准溶液的1％比吸光系数。(c)标准工作液的配制：维生素A和维生素E混合标准工作液的制备：将步骤(2)中标准储备液A稀释得到8ppm的溶液与标准储备液B稀释得到80ppm的溶液等体积混合，再依次用乙醇等比稀释，得到浓度为0.0625μg/mL、0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL和4.0μg/mL的维生素A标准工作液，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月，得到浓度为0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL和40μg/mL的标准工作液，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月。(d)标准内标储备液的配制：精确称取维生素A乙酸酯标准品10mg，置于10mL容量瓶，用乙醇溶解，并定容于10mL，得到标准储备液C，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月。精确称取维生素E乙酸酯标准品150mg，置于10mL容量瓶，用乙醇溶解，并定容于10mL，得到标准储备液D，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月。(e)内标工作液的配制从标准储备液C稀释得到15μg/mL的储备液，稀释液为乙醇，与标准储备液D等比混合，得到含维生素A乙酸酯7.5μg/mL和维生素E乙酸酯7500μg/mL的内标工作液，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月。(三)样品前处理(1)用移液枪移取10ul步骤(e)中所述内标工作液于1.5ml塑料离心管中，加入100ul步骤(一)中所述血清；(2)再加入100ul纯水，2000r/min涡旋混匀30秒，再移取200ul乙醇于上述离心管中，2000转/分钟涡旋混匀60秒；(3)用移液抢移取400μL正己烷，2000r/min涡旋混匀5分钟，以达到充分萃取的目的，然后12000r/min高速离心10分钟；(4)移取350μL上清液到1.5ml塑料离心管中，常温下N2缓慢吹干；(5)向上述吹干的离心管中加入100μL复溶液，所述复溶液为甲醇、乙醇或乙腈，2000r/min涡旋混匀1分钟，12000r/min高速离心5分钟，得到处理后的上清液样品待测；(四)取步骤(三)中处理后的上清液样品80μL放入自动进样瓶中经液相色谱法进行分析，使用荧光检测器检测，同时定量检测血液中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)的含量，所述液相色谱测定条件如下：色谱柱：ZORBAXEclipseXDB-C8，5um，2.1mm×50mm(Agilent公司)柱温：25℃；流动相：纯水-甲醇，采用梯度洗脱程序；表1液相色谱梯度洗脱程序时间(min)A(V,％)B(V,％)0.0014860.514860.519913.09913.5114864.201486流速：1.0mL/min；进样量：5μL；表2荧光检测器设置时间(min)激发波长(nm)发射波长(nm)0～1.303254701.3-4.2295330血清样本中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)及其内标的色谱图见图1，标准溶液中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)及其内标的色谱图见图2，维生素A、维生素A乙酸酯、维生素E和维生素E乙酸酯的保留时间分别为0.57min、0.90min、2.25min和2.90min，由图1和图2可知本实施例方法以维生素A乙酸酯、维生素E乙酸酯为内标，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。实施例2一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，采用液相色谱串联质谱进行检测，包括如下步骤：(一)将全血离心，离心速度为3500r/min，离心时间为10min，取上清液得血清，所述血清置于4℃-8℃冷藏避光条件下保存(24h内)至分析前备用，或置于-20℃冷冻避光条件下(避免反复冻融)保存(72h内)至分析前备用，或置于-80℃冷冻避光条件下(避免反复冻融)保存(30天内)至分析前备用；(二)标准溶液的标定六种不同浓度的标准品的混合标准工作液90ul分别和10ul混合内标工作液以1400r/min涡旋混匀30秒，充分混匀，制作标准曲线系列溶液；标准曲线系列溶液在检测前必须进行紫外分光光度计重新标定浓度；所述标准品为视黄醇和α-生育酚，所述混合内标工作液为三氘代视黄醇和六氘代α-生育酚混合液，所述标准曲线系列溶液经液相色谱法分析，绘制标准曲线；(a)标准储备液的配制精确称取视黄醇标准品10mg，置于10ml容量瓶，用乙醇溶解，并定容于10ml，得到标准储备液A，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月；精确称取α-生育酚标准品10mg，置于10ml容量瓶，用乙醇溶解，并定容于10ml，得到标准储备液B，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月。(b)标准校正液的配制维生素A：从步骤(a)中标准储备液A吸取20μl，置5ml容量瓶中，用无水乙醇定容，混匀；用紫外分光光度计重新标定浓度，在325nm波长下测定其紫外吸光值，结合标准比吸光系数，按照公式(1)和(2)计算出标准储备液A的实际浓度，维生素A的1％比吸光系数为1835。整个过程避光操作。维生素E：从步骤(a)中标准储备液B吸取20μl，置5ml容量瓶中，用无水乙醇定容，混匀；用紫外分光光度计重新标定浓度，在294nm波长下测定其紫外吸光值，结合标准比吸光系数，按照公式(1)和(2)计算出标准储备液B的实际浓度，维生素E的1％比吸光系数为71。整个过程避光操作。稀释倍数＝10000*5ml/20μl……………………………(2)式中：CX—待标定的标准溶液的实际浓度值；g/100mlA—294nm处测定的待标定标准溶液的吸光度平均值；E—维生素E的1％比吸光系数；(c)标准工作液的配制维生素A和维生素E混合标准工作液的制备：标准储备液A稀释得到1.8μg/mL的溶液与标准储备液B稀释得到18μg/mL的溶液等比混合，再依次用乙醇等比稀释，得到浓度分别0.014μg/mL、0.028μg/mL、0.056μg/mL、0.113μg/mL、0.225μg/mL、0.45μg/mL和0.90μg/mL的维生素A标准工作液，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月；得到浓度分别0.14μg/mL、0.28μg/mL、0.56μg/mL、1.13μg/mL、2.25μg/mL、4.50μg/mL和9.00μg/mL的维生素E标准工作液，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月。(d)标准内标储备液的配制精确称取维生素A同位素内标三氘代视黄醇2mg，置于10mL容量瓶，用乙醇溶解，并定容于10mL，得到标准储备液C(200μg/mL)，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月。用2mL无水乙醇溶解维生素E同位素内标六氘代α-生育酚1mg，得到标准储备液D(500μg/mL)，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月。(e)内标工作液的配制将步骤(d)中标准储备液C稀释得到0.225μg/mL的储备液，标准储备液D稀释得到2.25μg/mL的储备液，稀释液为乙醇，两者等比混合，得到含维生素A同位素内标三氘代视黄醇0.1125μg/mL和维生素E同位素六氘代α-生育酚1.125μg/mL的内标工作液，-80℃避光(避免反复冻融)条件下保存，有效期3个月。(三)样品前处理(1)用移液枪移取10ul步骤(e)中所述内标工作液于1.5ml塑料离心管中，加入10ul血浆；(b)再加入100ul纯水，2000r/min涡旋混匀30s，再移取200ul乙醇于上述离心管中，2000转/分钟涡旋混匀60秒；(c)用移液抢移取400μL正己烷，2000r/min涡旋混匀5分钟，以达到充分萃取的目的，然后12000r/min高速离心10分钟；(d)移取350μL上清液到1.5ml塑料离心管中，常温下N2缓慢吹干；(e)向上述吹干的离心管中加入100μL复溶液，所述复溶液为甲醇、乙醇或乙腈，2000r/min涡旋混匀1分钟，12000r/min高速离心5分钟，得到处理后的上清液样品待测；(四)取步骤(三)中处理后的上清液样品80μL放入自动进样瓶中经液相色谱串联质谱法进行分析，同时定量检测血液中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)的含量，所述液相色谱串联质谱测定条件如下：色谱柱：ZORBAXEclipseXDB-C8，5um，2.1mm×50mm(Agilent公司)柱温：28℃；流动相：A甲醇(含体积比为0.1％的甲酸)：B水(含体积比为0.1％的甲酸)，采用梯度洗脱程序；表3液相色谱串联质谱梯度洗脱程序时间(min)A(V,％)B(V,％)0.0085150.3085150.319552.009552.0185154.008515流速：0.4mL/min；进样量：5μL；表4串联质谱条件数据采集方式：(多反应监测模式)MRM；雾化气温度：350℃；雾化气气流：10L/min；雾化气压：28psi；毛细管电压：4000V；离子源：电喷雾离子源；离子化模式：正离子模式。本实施例中技术方法论证如下：一、该方法的线性关系和定量限将上述配制的90μl的各个浓度的维生素A标准工作液和维生素E标准工作液进行混合，再加10μl混合内标工作液，混匀进样50μl，按本实施例测定条件浓度由低到高进行测定，以定量离子峰面积一浓度作图，得到标准曲线，结果表明维生素A和维生素E的线性范围和定量限如下：(1)检测限(LOD)：VA为0.02mg/L；VE为0.20mg/L。(2)定量限(LOQ):VA为0.06mg/L；VE为0.60mg/L。(3)线性范围：维生素A在0.1mg/L到4.0mg/L范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.995；维生素E在0.9mg/L到30.0mg/L范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.995。二、该方法的回收率和精密度分别取维生素A和维生素E标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率和精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定6批次，维生素A和维生素E的回收率和精密度分别如表5和表6。维生素A在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为90.3％～94.0％，相对标准偏差为1.02％～4.35％，结果见表5。维生素E在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为104.9％～112.4％，相对标准偏差为0.07％～1.88％，结果见表6。表5.维生素A加样回收率和精密度加标量0.60mg/L2.38mg/L4.76mg/L平均回收率92.1％94.0％90.3％精密度RSD1.02％2.74％4.35％表6.维生素E加样回收率和精密度加标量1.07mg/L5.34mg/L10.67mg/L平均回收率104.9％105.4％112.4％精密度RSD1.88％0.07％1.73％综合上述验证试验，本实施例2的回收率，检测限和精密度等各项技术指标均符合要求，该方法同时检测血液中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)，重现性良好，且能够大幅度提高加样回收率，从而大大提高检测结果的准确度，消除系统误差。本实施例中血清样本中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)的选择离子流图如图3所示，维生素A的维生素E保留时间分别为1.40min和3.00min。血清样本中维生素A(视黄醇)选择离子流图和特征质谱图分别如图4和图5所示；血清样本中维生素A同位素内标的选择离子流图和特征质谱图分别如图6和图7所示；血清样本中维生素E同位素内标的选择离子流图和特征质谱图分别如图8和图9所示；血清样本中维生素E同位素内标的选择离子流图和特征质谱图分别如图10和图11所示。由图3-11可见，维生素A(视黄醇)和维生素E的保留时间和相对丰度均与其标准工作溶液一致，该方法以同位素标记物为内标，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。当前第1页1 2 3