基于凝血酶荧光底物金球双标记探针检测乙肝病毒表面抗原的酶联免疫试剂盒制备方法与流程

本发明涉及疾病检测技术领域，更具体的是涉及一种基于凝血酶荧光底物金球双标记探针检测乙肝病毒表面抗原的酶联免疫试剂盒制备方法。

背景技术：

乙肝表面抗原(HBsAg)是乙肝病毒的外壳蛋白，本身不具有传染性，但它的出现常伴随乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的标志。它可存在于患者的血液、唾液、乳汁、汗液、泪水、鼻咽分泌物、精液及阴道分泌物中。在感染乙肝病毒后2～6个月，当丙氨酸氨基转移酶升高前2～8周时，可在血清中测到阳性结果。急性乙型肝炎患者大部分可在病程早期转阴，慢性乙型肝炎患者该指标可持续阳性。乙肝表面抗原(HBsAg)滴度表示HBsAg在血清中的含量。高滴度的HBsAg常表示病毒的高复制水平；低滴度的HBsAg可能是由于在感染恢复时期病毒低复制，或者在炎症活动时病毒和抗原部分清除；少数情况下是由于病毒变异，引起HBsAg抗原性改变，从而与试剂抗体的亲和性降低，表现为临床检查HBsAg低滴度。血清HBsAg在疾病早期出现。一般在ALT升高前2～6周，在血清中即可检出HBsAg。HBsAg阳性是乙肝病毒感染的主要标志。血清HBsAb的出现，是乙肝病毒感染恢复的标志。注射过乙肝疫苗者，也可出现血清HBsAb阳性，提示已获得对乙肝病毒的特异性免疫，因此对乙肝表面抗原进行检测有着非常的意义。

纳米科技是指在纳米尺度(1nm到l00nm之间)上研究物质的特性和相互作用，比如原子和分子，以及利用这些特性的多学科交叉的科学和技术。当物质小到1-100nm时，其量子效应、物质的局域性及巨大的表面及界面效应使物质的很多性能发生质变，呈现出许多既不同于宏观物体，也不同于单个孤立原于的奇异现象。金纳米粒子因其较高的电荷密度和较大的比表面积，因此被广泛应用于标记领域。

凝血酶(Thrombin)荧光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110是一种双酰胺衍生物的罗丹明110(Rhodamine110)分子探针，是一个敏感的和有选择性的测定蛋白酶在溶液中或在活细胞内底物。这些荧光底物含有一种氨基酸或肽共价连接到每个Rhodamine110的氨基，酶裂解后，非荧光双酰胺底物首先转化为弱荧光单酰胺，然后转化为强荧光的Rhodamine110，荧光会进一步增加。由于Rhodamine110具有较大的消光系数，所以实验的信噪比很高。此外，相比于普通的荧光素而言，Rhodamine110的荧光在pH3-9之间会保持稳定。目前荧光检测因具有优异的光学性质已经被广泛应用于示踪、成像以及标记等方面，而ELISA则因为它的灵敏度高、特异性强等优点在检测领域处于特殊重要的地位。所以本文拟研制基于凝血酶荧光底物金球双标记探针检测乙肝病毒表面抗原的酶联免疫试剂盒，对乙肝病毒表面抗原进行检测。

技术实现要素：

鉴于血液标志物在肿瘤检测中的重要地位、荧光检测独特的光学性质以及酶联免疫检测技术的优势。我们将结合酶联免疫检测和荧光检测两种技术，利用金纳米粒子标记凝血酶和乙肝病毒相应抗体Ab₂制得检测探针。探针、肿瘤标志物和包埋在酶联免疫ELISA试剂盒的另一种乙肝病毒抗体Ab₁通过抗体抗原之间的作用，形成一种类似夹心的结构，最后通过酶和荧光底物的作用产生荧光，对乙肝病毒表面抗原进行定性定量的检测，建立血液标志物检测的新方法，极大程度提高了检测灵敏度。

本发明制备的基于凝血酶荧光底物金球双标记探针检测乙肝病毒表面抗原的酶联免疫试剂盒，其特征是利用金纳米粒子同时标记抗体分子和凝血酶分子制备双标记酶标免疫探针，选用凝血酶荧光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110特异性降解产生的荧光对乙肝病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)进行定量检测，其结构式如下：

本发明的技术方案如下：

一种基于凝血酶荧光底物金球双标记探针检测乙肝病毒表面抗原的酶联免疫试剂盒；其步骤如下：

1)将新制备的金纳米粒子溶液(Gold nanoparticles,AuNPs)通过碳酸钾溶液调节pH为9.0～9.5，加入凝血酶Thrombin和乙肝病毒标记抗体Ab₂混合蛋白溶液，充分混匀后室温下静置2～3h，离心得到酶联检测探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂，复溶于BSA的PBS缓冲液中，4℃贮存备用；

2)将乙肝病毒包被抗体Ab₁加入96孔酶标板，静置过夜处理后用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入BSA封闭处理后再次用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，之后加入标准乙肝病毒表面抗原或乙肝病人血清样本缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入上述酶联检测探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，最后加入凝血酶荧光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧光强度值。

所述碳酸钾溶液是浓度为0.15M的碳酸钾溶液；PBS缓冲液是0.01M pH7.4的缓冲液，且BSA的质量体积比为0.1～1％。

所述金纳米粒子：蛋白溶液质量比为1:2～10；凝血酶：乙肝病毒标记抗体质量比为1～6:1；

所述乙肝病毒包被抗体Ab₁浓度为10～50μg/mL。

所述洗涤缓冲液是含有0.05～0.5％Tween-20的0.01M pH7.4的PBS缓冲液。

所述检测原理是根据凝血酶荧光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110降解产生的荧光强度值和乙肝病毒表面抗原HBsAg浓度之间的关系建立标准曲线，定性定量检测乙肝病毒表面抗原HBsAg。

通过静电吸附作用将乙肝病毒记抗体Ab₂和凝血酶酶Thrombin连接到金纳米粒子AuNPs上，得到酶联检测探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂。将乙肝病毒包被抗体Ab1加入96孔酶标板，4℃过夜后用洗涤缓冲液洗涤96孔酶标板，加入BSA 37℃封闭处理后用洗涤缓冲液洗涤96孔酶标板，在96孔酶标板加入待检样品37℃下反应后用洗涤缓冲液洗涤96孔酶标板，加入上述multi-thrombin-AuNP-Ab₂检测探针37℃下反应后用洗涤缓冲液洗涤96孔酶标板，加入凝血酶荧光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110，最后用荧光酶标仪读数。如果检测样品有乙肝病毒表面抗原HBsAg存在，探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂、HBsAg和包埋在96孔酶标板上的乙肝病毒包被抗体Ab₁通过抗体抗原之间的作用，形成一种类似夹心的结构multi-thrombin-AuNP-Ab₂-Ag-Ab₁，此时凝血酶荧光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110在酶的作用下降解产生荧光；如果检测样品没有HBsAg存在，则96孔酶标板的检测探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂将被洗涤缓冲液清洗，此时凝血酶荧光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110不会降解，没有荧光出现。在96孔酶标板上加入不同浓度的标准HBsAg，建立标准曲线，定性定量检测HBsAg。

本发明制备的基于凝血酶荧光底物金球双标记探针检测乙肝病毒表面抗原的酶联免疫试剂盒；其步骤如下优势在于：

1.采用弹性蛋白酶荧光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110这种具有优异的光学性质的双酰胺衍生物的罗丹明110(R110)分子探针，由于Rhodamine110具有较大的消光系数，所以实验的信噪比很高。此外，相比于普通的荧光素而言，Rhodamine110的荧光在pH3-9之间会保持稳定。

2.采用酶联免疫检测ELISA这种具有灵敏度高、特异性强等优点的传统检测技术，有利于提高检测效率。

3.采用静电吸附作用乙肝病毒标记抗体Ab₂和凝血酶Thrombin连接得到金纳米粒子上制备酶联检测探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂，夹心结构降解荧光底物产生的荧光强度，定性定量检测乙肝病毒表面抗原HBsAg，有效地降低了检测荧光背景。

如图1所示，凝血酶荧光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110酶裂解后，非荧光双酰胺底物率先转化为一对弱荧光的单酰胺，然后转化为强荧光的Rhodamine110，荧光进一步增加，实现超灵敏检测。如图2所示，金纳米粒子双标记探针，所依赖的原理是带负电的金纳米粒子和带正电的静电吸附。如图3所示，根据加入不同浓度标准乙肝病毒表面抗原所得荧光强度，建立标准曲线可知本发明制备的凝血酶荧光底物金球双标记探针检测乙肝病毒表面抗原的酶联免疫试剂盒检测灵敏度较高，达到1*10^-7IU/mL；图4根据加入不同抗原，可知本发明制备的凝血酶荧光底物金球双标记探针检测乙肝病毒表面抗原的酶联免疫试剂盒特异性很好。

附图说明

图1本发明制备的基于凝血酶荧光底物金球双标记探针检测乙肝病毒表面抗原的酶联免疫试剂盒荧光底物分子式及其裂解产物分子式。

图2本发明制备的基于凝血酶荧光底物金球双标记探针检测乙肝病毒表面抗原的酶联免疫试剂盒探针示意图。

图3本发明制备的基于凝血酶荧光底物金球双标记探针检测乙肝病毒表面抗原的酶联免疫试剂盒标准曲线。

图4本发明制备的基于凝血酶荧光底物金球双标记探针检测乙肝病毒表面抗原的酶联免疫试剂盒特异性曲线。

具体实施方式

下面的实施案例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。

实施案例1：

1)将新制备的5mL 5ng/mL的金纳米粒子溶液(Gold nanoparticles,AuNPs)通过0.15M碳酸钾溶液调节pH为9.0，加入0.1mg凝血酶Thrombin和0.025mg乙肝病毒标记抗体Ab₂混合蛋白溶液，充分混匀后室温下静置2h，离心得到酶联检测探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂，复溶于BSA的PBS缓冲液中，4℃贮存备用；

2)将24ug/mL乙肝病毒包被抗体Ab₁加入96孔酶标板，静置过夜处理后用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入10mg/mL BSA封闭处理后再次用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，之后加入标准乙肝病毒表面抗原或乙肝病人血清样本缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入上述酶联检测探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，最后加入凝血酶荧光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧光强度值。

实施案例2：

1)将新制备的5mL 5ng/mL的金纳米粒子溶液(Gold nanoparticles,AuNPs)通过0.15M碳酸钾溶液调节pH为9.0，加入0.2mg凝血酶Thrombin和0.05mg乙肝病毒标记抗体Ab₂混合蛋白溶液，充分混匀后室温下静置2h，离心得到酶联检测探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂，复溶于BSA的PBS缓冲液中，4℃贮存备用；

2)将24ug/mL乙肝病毒包被抗体Ab₁加入96孔酶标板，静置过夜处理后用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入10mg/mL BSA封闭处理后再次用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，之后加入标准乙肝病毒表面抗原或乙肝病人血清样本缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入上述酶联检测探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，最后加入凝血酶荧光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧光强度值。

实施案例3：

1)将新制备的5mL 5ng/mL的金纳米粒子溶液(Gold nanoparticles,AuNPs)通过0.15M碳酸钾溶液调节pH为9.0，加入0.04mg凝血酶Thrombin和0.01mg乙肝病毒标记抗体Ab₂混合蛋白溶液，充分混匀后室温下静置2h，离心得到酶联检测探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂，复溶于BSA的PBS缓冲液中，4℃贮存备用；

2)将24ug/mL乙肝病毒包被抗体Ab₁加入96孔酶标板，静置过夜处理后用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入10mg/mL BSA封闭处理后再次用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，之后加入标准乙肝病毒表面抗原或乙肝病人血清样本缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入上述酶联检测探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，最后加入凝血酶荧光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧光强度值。

实施案例4：

1)将新制备的5mL 5ng/mL的金纳米粒子溶液(Gold nanoparticles,AuNPs)通过0.15M碳酸钾溶液调节pH为9.0，加入0.0625mg凝血酶Thrombin和0.0625mg乙肝病毒标记抗体Ab₂混合蛋白溶液，充分混匀后室温下静置2.5h，离心得到酶联检测探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂，复溶于BSA的PBS缓冲液中，4℃贮存备用；

2)将10ug/mL乙肝病毒包被抗体Ab₁加入96孔酶标板，静置过夜处理后用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入5mg/mL BSA封闭处理后再次用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，之后加入标准乙肝病毒表面抗原或乙肝病人血清样本缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入上述酶联检测探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，最后加入凝血酶荧光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧光强度值。

实施案例5：

1)将新制备的5mL 5ng/mL的金纳米粒子溶液(Gold nanoparticles,AuNPs)通过0.15M碳酸钾溶液调节pH为9.0，加入0.1072mg凝血酶Thrombin和0.0178mg乙肝病毒标记抗体Ab₂混合蛋白溶液，充分混匀后室温下静置3h，离心得到酶联检测探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂，复溶于BSA的PBS缓冲液中，4℃贮存备用；

2)将50ug/mL乙肝病毒包被抗体Ab₁加入96孔酶标板，静置过夜处理后用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入1mg/mL BSA封闭处理后再次用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，之后加入标准乙肝病毒表面抗原或乙肝病人血清样本缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入上述酶联检测探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，最后加入凝血酶荧光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧光强度值。

实施案例6：

1)将新制备的5mL 5ng/mL的金纳米粒子溶液(Gold nanoparticles,AuNPs)通过0.15M碳酸钾溶液调节pH为9.0，加入0.1mg凝血酶Thrombin和0.025mg乙肝病毒标记抗体Ab₂混合蛋白溶液，充分混匀后室温下静置2h，离心得到酶联检测探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂，复溶于BSA的PBS缓冲液中，4℃贮存备用；

2)将24ug/mL乙肝病毒包被抗体Ab₁加入96孔酶标板，静置过夜处理后用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入10mg/mL BSA封闭处理后再次用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，之后每孔加入100μL乙肝病毒表面抗原的浓度分别为100U/mL、10U/mL、1U/mL、0.1U/mL、0.01U/mL、0.001U/mL、0.0001U/mL、0U/mL，缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入上述酶联检测探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，最后加入凝血酶荧光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧光强度值。

实施案例7：

1)将新制备的5mL 5ng/mL的金纳米粒子溶液(Gold nanoparticles,AuNPs)通过0.15M碳酸钾溶液调节pH为9.0，加入0.1mg凝血酶Thrombin和0.025mg乙肝病毒标记抗体Ab₂混合蛋白溶液，充分混匀后室温下静置2h，离心得到酶联检测探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂，复溶于BSA的PBS缓冲液中，4℃贮存备用；

2)将24ug/mL乙肝病毒包被抗体Ab₁加入96孔酶标板，静置过夜处理后用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入10mg/mL BSA封闭处理后再次用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，之后每孔加入HCG、BSA、PBS、CEA、CA125、AFP、PSA、CA153抗原，缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入上述酶联检测探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，最后加入凝血酶荧光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧光强度值。