基于凝血酶荧光底物金球双标记探针检测乙肝病毒表面抗原的酶联免疫试剂盒制备方法与流程

技术特征：

1.一种基于凝血酶荧光底物金球双标记探针检测乙肝病毒表面抗原的酶联免疫试剂盒制备方法，其特征是利用金纳米粒子同时标记抗体分子和凝血酶分子制备双标记酶标免疫探针，选用凝血酶荧光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110特异性降解产生的荧光对乙肝病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)进行定量检测，其结构式如下：

2.权利要求1的基于凝血酶荧光底物金球双标记探针检测乙肝病毒表面抗原的酶联免疫试剂盒制备方法，其特征在于步骤如下：

1)将新制备的金纳米粒子溶液(Gold nanoparticles,AuNPs)通过碳酸钾溶液调节pH为9.0～9.5，加入凝血酶Thrombin和乙肝病毒标记抗体Ab₂混合蛋白溶液，混和后室温下静置2～3h，离心得到酶联检测探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂，复溶于BSA的PBS缓冲液中，4℃贮存备用；

2)将乙肝病毒包被抗体Ab₁加入96孔酶标板，静置过夜处理后用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入BSA封闭处理后再次用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，之后加入标准乙肝病毒表面抗原或乙肝病人血清样本缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入上述酶联检测探针multi-thrombin-AuNP-Ab₂，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，最后加入凝血酶荧光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧光强度值。

3.如权利要求2所述的方法，其特征是碳酸钾溶液是浓度为0.15M的碳酸钾溶液；PBS缓冲液是0.01M pH7.4的缓冲液，且BSA的质量体积比为0.1～1％。

4.如权利要求2所述的方法，其特征是金纳米粒子：蛋白溶液质量比为1:2～10；凝血酶：乙肝病毒标记抗体质量比为1～6:1。

5.如权利要求2所述的方法，其特征是乙肝病毒包被抗体Ab₁浓度为10～50μg/mL。

6.如权利要求2所述的方法，其特征是洗涤缓冲液是含有0.05～0.5％Tween-20的0.01M pH7.4的PBS缓冲液。

7.如权利要求2所述的方法，其特征是根据凝血酶荧光底物(p-tosyl-Gly-Pro-Arg)2-R110降解产生的荧光强度值和乙肝病毒表面抗原HBsAg浓度之间的关系建立标准曲线，定性定量检测乙肝病毒表面抗原HBsAg。