一种雨生红球藻提取物中虾青素的分离检测方法与流程

本发明属于化学分析领域，具体涉及一种雨生红球藻提取物中虾青素的分离检测方法。

背景技术：

虾青素是一种氧化型类胡萝卜素，天然来源有雨生红球藻，酵母真菌，虾壳和蟹壳，虾青素也是一种酮式类胡萝卜素，有与其他类胡萝卜素一样很长的共轭双键，在末端有不饱和的酮基和羟基，羟基和酮基构成α-羟基酮，天然产物多以酯的形式存在。

虾青素在抗氧化，抗炎，提高免疫力，改善视力，降低血脂胆固醇等方面有益处，它能有效清除自由基，并抑制自由基的产生，避免细胞受到损伤，天然虾青素也是一种超强的抗氧化剂，在类胡萝卜素家族中有独特的优势，淬灭单线态氧，结束过氧化链式反应，保护细胞免受氧化反应伤害，被誉为“超级维生素E”、“超级抗氧化剂”。

目前虾青素的检测方法主要有：

一、分光光度法：

夏三年等用紫外分光光度计检测虾青素的含量中：前处理方法为：用含醋酸的DMSO溶解样品，定量方法为：在492nm波长下测定吸光度，并通过消光系数计算虾青素的含量。该方法的不足之处在于：该波长范围内测量总类胡萝卜素的含量，造成检测结果偏高。

二、高效薄层色谱法：

黄萌等在南极磷虾虾青素的提取与纯化研究中，用薄层色谱法对虾青素分离纯化和含量分析，前处理方法为：用正己烷和丙酮溶解萃取样品，并进行皂化，定量方法为：外标法得到工作曲线，并计算虾青素的含量。该方法的不足之处在于：皂化相对于酶解，操作复杂，转化效率不高。

三、高效液相色谱法：

肖冬光等用高效液相色谱法检测红发夫酵母胞内的虾青素含量，该方法前处理为：用丙酮溶解提取样品，甲醇和乙腈作为洗脱液进行上机分离，定量方法为：外标法制作工作曲线，并计算虾青素的含量，该方法的不足之处为：未经过酶解，造成检测样品中虾青素的含量偏低，采用反相系统的上机条件，未能将各平面异构体分出。

余孔捷等用高效液相色谱法测定动物源性食品如肉蛋奶动物内脏中的虾青素。该方法前处理为：用乙腈和正己烷溶解萃取样品，反相系统上机条件，外标法制作工作曲线，并计算虾青素的含量，该方法的不足之处为：未经过酶解，造成检测样品中虾青素的含量偏低，采用反相系统的上机条件，出峰时间偏长。

陈晋明等用反相高效液相色谱检测雨生红球藻粉的虾青素含量，该方法前处理为：用甲醇和二氯甲烷溶解提取样品，反相系统上机条件，外标法制作工作曲线，并计算虾青素的含量，该方法的不足之处为：未经过酶解，造成检测样品中虾青素的含量偏低，采用反相系统的上机条件，未能将各平面异构体分出。

在中国专利CN 103630626 A中，采用C18柱，流动相为二氯甲烷，甲醇，乙腈和水等反相上机条件，梯度洗脱，对上机条件要求较高，基线不易走稳，未采用酶解，造成计算虾青素的含量偏低，未能将各平面异构体分开。

综合分析现有的虾青素检测方法中，分光光度的方法，在最大吸收波长范围内还包括其他类胡萝卜素的物质，会造成检测结果偏高，薄层色谱的方法，操作相对较为繁琐，而大部分的检测方法为高效液相方法为主，提取试剂多为有机试剂，乙腈，甲醇，丙酮，氯仿等，前处理步骤需要将酯化虾青素转变为游离虾青素，很多前处理用皂化的方式进行，皂化的时间长，转化的效率不高；有的没有采用将酯化虾青素转化为游离虾青素的步骤，会造成虾青素检测含量的降低。在上机条件上大多数多采用乙腈(水)、甲醇等极性较高的溶液作为洗脱液，亲水性溶剂与虾青素的互溶性不高，提取率不高，反相系统洗脱时多采用梯度洗脱，对上机条件有较高的要求，基线不易走稳，对定量会有一定的影响，目标峰的洗脱出峰时间多在15-30分钟，出峰时间较长，不利于批量检测含量，峰的分离度不高，不能把虾青素的各种平面异构体分离出来，其平面异构体包括：反式虾青素(trans astaxanthin)，双顺式虾青素#1(Di-cisastaxanthin#1)，双顺式虾青素#2(Di-cis astaxanthin#2)，9-顺式虾青素(9-cis astaxanthin)，13-顺式虾青素(13-cis astaxanthin)，15-顺式虾青素(15-cis astaxanthin)。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明旨在提供一种快速简单、准确度高、分离度高的雨生红球藻中虾青素的分离检测方法。

本发明采取的技术方案如下：

一种雨生红球藻提取物中虾青素的分离检测方法，包括以下步骤：

步骤一，雨生红球藻提取物中类胡萝卜素的提取：按照雨生红球藻提取物与丙酮质量体积比1：20-200的比例将两者混合均匀，离心去沉淀，留取上清液；

步骤二，类胡萝卜素的酶解：向步骤一中的上清液中加入终浓度0.01-0.1M pH7.0的Tris-HCl缓冲液，混匀后加入胆固醇酯酶，加入量为20-350U/mg提取物，37℃酶解30-60分钟；酶解完后向酶解液中加入0.5-2g无水硫酸钠除水和1-2ml石油醚萃取，离心，收集石油醚层；重复萃取步骤，直至萃取完全，合并石油醚层，用氮气或惰性气体吹干，加入洗脱液溶解，并定容至与被酶解的上清液体积相同，得到待测液；所述洗脱液为正己烷与丙酮的混合液，正己烷：丙酮体积比＝75％:25％-90％:10％；

步骤三，正相高效液相分析法分离检测虾青素：液相上机条件为：检测波长在474nm，色谱柱为Luna 3μSilica(2)，色谱柱温度20-25℃，流速1-1.2ml/分钟，流动相为正己烷：丙酮体积比＝75％:25％-90％:10％，等度洗脱；

分别运行样品：反式虾青素标准溶液，待测液；

运行反式虾青素标准溶液后，计算峰值面积P_STA；

运行待测液后，分别计算双顺式虾青素#1的峰值面积P_DCA1，双顺式虾青素#2的峰值面积P_DCA2，反虾青素的峰值面积P_TA，9-顺式虾青素的峰值面积P_9CA，13-顺式虾青素的峰值面积P_13CA，15-顺式虾青素的峰值面积P_15CA；

虾青素的峰值面积率PAR_AX为：

PAR_AX＝(P_DCA1+P_DCA2+P_TA+1.133×P_9CA+1.60×P_13CA+P_15CA)÷P_STA

虾青素含量百分比AXP为：

AXP＝(PAR_AX×C_STA×D×100)÷W

式中，C_STA为反式虾青素标准溶液的浓度，W为步骤一中雨生红球藻提取物的重量，D为步骤一中溶解雨生红球藻提取物所用丙酮的体积。

所述雨生红球藻提取物为雨生红球藻来源的虾青素油酯或虾青素胶囊或雨生红球藻破壁后的产物。

进一步地，所述方法中还可以增加分光光度法的步骤，以与高效液相色谱法的含量检测做相互验证，具体方法为：用分光光度计检测步骤一上清液在474nm波长下的吸光度值A，计算类胡萝卜素总量W_{类胡萝卜素}和虾青素百分比含量AXP；

W_{类胡萝卜素}＝A×D/210，其中210为虾青素在丙酮中的消光系数；

AXP＝W_{类胡萝卜素}×85％/W，其中85％是全部类胡萝卜素中的虾青素含量百分数。

进一步地，所述方法中还可以增加计算回收率的步骤以验证方法的可行性，具体方法为：

(1)称取2mg反式-β-阿林胡萝卜醛标准品，用3ml二氯甲烷溶解后，用丙酮定容到100ml，取其中1ml用洗脱液定容到10ml，此为反式-β-阿林胡萝卜醛标准溶液，在上述步骤一的上清液中加入50μl反式-β-阿林胡萝卜醛标准溶液，按虾青素含量检测的步骤依次往下进行至液相上机待测，此为待测液。

(2)反式-β-阿林胡萝卜醛标准溶液在458nm检测，计算峰值面积P_IS；

(3)待测液在458nm检测，计算反式-β-阿林胡萝卜醛的峰值面积P_ISS，并计算内部标准的回收率PR_IS＝(PISS×100)÷P_IS；

进一步地，各步骤中的所有检测均设置数个平行实验，结果取平均值。

进一步地，步骤一中雨生红球藻提取物在丙酮中的终浓度通过数次稀释完成，一是避免体积过大，二是浓度更精确。

进一步地，步骤一中所述离心转速为3800-4200转/分钟，时间2-5分钟。

进一步地，步骤二中所述离心转速为3800-4200转/分钟，时间0.5-1分钟。

进一步地，步骤三中色谱柱配备色谱防护装置。

进一步地，步骤三中反式虾青素标准溶液的制备方法为：用洗脱液将反式虾青素标准品稀释成浓度为0.001-0.01mg/ml的标准溶液。

相对于现有技术，本发明的方法具有以下优势：

(1)前处理效率高，提取试剂丙酮与虾青素的互溶性好，酶解相对于皂化时间短，效率高。

(2)高效液相色谱上机条件好：等度洗脱，基线更易平稳，峰形好，分离度高，可以分离更多的同分异构体。

(3)出峰时间短，不易受外界光热影响，更适合大批量检测。

附图说明

图1实施例1回收率反式-β-阿林胡萝卜醛标准溶液的正相色谱图；

图2实施例1待测液的正向高效液相色谱图(458nm)；

图3实施例1反式虾青素标准溶液的正向高效液相色谱图；

图4实施例1待测液的正向高效液相色谱图(474nm)；

图5实施例2反式虾青素标准溶液的正向高效液相色谱图；

图6实施例2待测液的正向高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

实施例1虾青素油脂中虾青素的分离检测

反式-β-阿林胡萝卜醛标准溶液的制备：称取2mg反式-β-阿林胡萝卜醛标准品，用3ml二氯甲烷溶解后，用丙酮定容到100ml，取其中1ml用洗脱液(正己烷：丙酮体积比＝82:18)定容到10ml，得到反式-β-阿林胡萝卜醛标准溶液。

反式虾青素标准溶液的制备：用洗脱液(正己烷：丙酮体积比＝82:18)将反式虾青素标准品稀释成浓度为0.00349mg/ml的标准溶液。

步骤一，虾青素油脂中类胡萝卜素的提取：

(1)精确称量33.8mg虾青素油脂至容量瓶中，加入丙酮定容至100ml，混匀后，4000rpm离心3min去沉淀，留取上清液，为第一次稀释液。吸取1ml第一次稀释液，用丙酮定容至10ml，得到提取液。本步骤中溶解33.8mg虾青素油脂至上机浓度应用丙酮体积为1000ml(D)。

(2)用分光光度计检测提取液在474nm波长下的吸光度值A＝0.4592，计算类胡萝卜素总量W_{类胡萝卜素}和虾青素百分比含量AXP；

W_{类胡萝卜素}＝A×D/210

AXP＝W_{类胡萝卜素}×85％/W＝(A×D/210)×85％/W＝5.50％。

步骤二，类胡萝卜素的酶解：

移取3ml提取液，加入50μl反式-β-阿林胡萝卜醛标准溶液，加入2ml 0.05M的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，混匀后加入3U/ml的胆固醇酯酶1ml，37℃酶解40分钟；酶解完后向酶解液中加入1g无水硫酸钠和2ml石油醚萃取，4000rpm离心30秒，收集石油醚层；重复萃取步骤，直至水层无色，萃取完全，合并石油醚层，用氮气吹干，加入洗脱液(正己烷：丙酮体积比＝82:18)溶解，并定容至3ml，得到待测液。

步骤三，正相高效液相分析法分离检测虾青素：

液相上机条件为：检测波长在474nm或458nm，色谱柱为Luna 3μSilica(2)，100A 150×4.60mm Phenomenex(货号P/N 00F-4162-E0)，带色谱防护装置(Phenomenex货号P/N AJO 4348&KJO 4282)，色谱柱温度25℃，固定流速1.2ml/分钟，注射量1.2μl，流动相为正己烷：丙酮体积比＝82:18，等度洗脱；

分别运行样品：反式-β-阿林胡萝卜醛标准溶液(检测波长在458nm)，待测液(检测波长在458nm)，反式虾青素标准溶液(检测波长在474nm)，待测液(检测波长在474nm)，色谱图分别见图1、2、3、4；

图4所示，待测液中各虾青素平面异构体的出峰时间分别为：

可见，本实施例组份的出峰时间非常快，5.03分钟时就已经出峰，7.01分钟时所有虾青素的平面异构体均出峰完毕。运行一次样品仅需10分钟，特别适用于大批量检测，能有效提高检测效率。且从图中可以看出，各峰之间无重叠，分离度极高。

运行反式-β-阿林胡萝卜醛标准溶液后，计算峰值面积P_IS＝113954

运行反式虾青素标准溶液后，计算峰值面积P_STA＝772789；

474nm运行待测液后，分别计算双顺式虾青素#1的峰值面积P_DCA1＝4507，双顺式虾青素#2的峰值面积P_DCA2＝4691，反虾青素的峰值面积P_TA＝300667，9-顺式虾青素的峰值面积P_9CA＝47002，13-顺式虾青素的峰值面积P_13CA＝24080，15-顺式虾青素的峰值面积P_15CA＝3904；458nm运行待测液后，反式-β-阿林胡萝卜醛的峰值面积P_ISS＝112751；

虾青素的峰值面积率PAR_AX为：

PAR_AX＝(P_DCA1+P_DCA2+P_TA+1.133×P_9CA+1.60×P_13CA+P_15CA)÷P_STA＝0.5289

虾青素含量百分比AXP为：

AXP＝(PAR_AX×C_STA×D×100)÷W＝0.5289×0.00349×1000×100÷33.8＝5.46％

计算内部标准的回收率PR_IS＝(P_ISS×100)÷P_IS＝98.9％。

回收率在90％-110％之间表明本发明方法具有可行性，分光光度结果比高效液相结果偏高表明正相高效液相的结果较之分光光度更加准确，同时也可将分光光度作为液相结果的先期验证。

实施例2虾青素胶囊中虾青素的分离检测

步骤一，虾青素胶囊中类胡萝卜素的提取：

(1)精确称量500mg虾青素胶囊内容物至容量瓶中，加入丙酮定容至100ml，混匀后，4200rpm离心2min去沉淀，留取上清液，为第一次稀释液。吸取0.5ml第一次稀释液，用丙酮定容至10ml，得到提取液。本步骤中溶解500mg虾青素胶囊内容物至上机浓度应用丙酮体积为2000ml(D)。

(2)用分光光度计检测提取液在474nm波长下的吸光度值A＝1.6256，计算类胡萝卜素总量W_{类胡萝卜素}和虾青素含量W_虾青素；

W_{类胡萝卜素}＝A×D/210

W_虾青素＝W_{类胡萝卜素}×85％＝(A×D/210)×85％＝13.16mg。

步骤二，类胡萝卜素的酶解：

移取3ml提取液，加入2ml 0.05M的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，混匀后加入3U/ml的胆固醇酯酶1ml，37℃酶解40分钟；酶解完后向酶解液中加入2g无水硫酸钠和1.5ml石油醚萃取，4200rpm离心30秒，收集石油醚层；重复萃取步骤，直至水层无色，萃取完全，合并石油醚层，用氮气吹干，加入洗脱液(正己烷：丙酮体积比＝90:10)溶解，并定容至3ml，得到待测液。

步骤三，正相高效液相分析法分离检测虾青素：

液相上机条件为：检测波长在474nm，色谱柱为Luna 3μSilica(2)，100A 150×4.60mmPhenomenex(货号P/N 00F-4162-E0)，带色谱防护装置(Phenomenex货号P/N AJO 4348&KJO4282)，色谱柱温度25℃，固定流速1ml/分钟，注射量20μl，流动相为正己烷：丙酮体积比＝90:10，等度洗脱；

制备反式虾青素标准溶液：用洗脱液(正己烷：丙酮体积比＝90:10)将反式虾青素标准品稀释成浓度为0.00484mg/ml的标准溶液。

474nm运行反式虾青素标准溶液，出峰时间7.108分钟，如图5所示，计算峰值面积P_STA＝1295.9；

474nm运行待测液，如图6所示，分别计算双顺式虾青素#1的峰值面积P_DCA1＝24.2(出峰时间6.582分钟)，双顺式虾青素#2的峰值面积P_DCA2＝23.6(出峰时间6.855分钟)，反虾青素的峰值面积P_TA＝1211.7(出峰时间7.175分钟)，9-顺式虾青素的峰值面积P_9CA＝239.1(出峰时间8.247分钟)，13-顺式虾青素的峰值面积P_13CA＝115.3(出峰时间8.683分钟)，15-顺式虾青素的峰值面积P_15CA＝15.4(出峰时间9.196分钟)。

虾青素的峰值面积率PAR_AX为：

PAR_AX＝(P_DCA1+P_DCA2+P_TA+1.133×P_9CA+1.60×P_13CA+P_15CA)÷P_STA＝1.335

虾青素重量W_虾青素为：

W_虾青素＝PAR_AX×C_STA×D＝1.335×0.00484×2000＝12.91mg

分光光度结果比高效液相结果偏高，表明正相高效液相的结果较之分光光度更加准确，同时也可将分光光度作为液相结果的先期验证。