本发明涉及一种羊布鲁氏菌病参考血清库，属于生物制品
技术领域：
。技术背景布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。布病在世界存在已有久远的历史，人类对该病的研究认识逐步加深，对布病的诊断方法在不断完善，准确率不断提高。总体上，布鲁氏菌诊断方法主要包括抗原诊断法和抗体诊断法，一般实验室，主要通过检测动物体内的布鲁氏菌抗体来判断动物是否感染布鲁氏菌。布鲁氏菌血清学方法不仅包括传统的凝集试验(如：虎红抗原平板凝集试验、试管抗原凝集试验、乳环凝集试验)，还包括敏感性高、特异性强的ELISA方法、荧光偏振试验(FPA)、胶体金试纸条等新的检测技术。凝集试验是布鲁氏菌病诊断的一种常用的方法，包括血清凝集实验、乳环沉淀试验和抗人免疫球蛋白试验，其中经典的标准试管凝集试验(STAT)、平板凝集试验(PAT)，以上方法在发达国家已经基本停止使用，取而代之的是缓冲布鲁氏菌抗原凝集试验如虎红平板凝集试验(RBPT)。虎红平板凝集抗原是用抗原性良好的布鲁氏菌菌株经培养，灭活，离心收集菌体后用虎红染料染色后悬浮于乳酸缓冲液中制成，该方法灵敏度高，价格便宜，操作方便，检测快速，适于动物群体布鲁氏菌病的普查。在国际贸易中是牛、羊、猪布鲁氏菌病检测的指定试验，在我国也用于人布鲁氏菌病监测的初筛。在布鲁氏菌病血清学检验中一致认为补体结合试验(CFT)在特异性上优于其他方法，常被用来对试管凝集试验和虎红平板凝集试验检测为阳性或可疑的病例进行定性检测。补体结合试验一直被认为是最有效的布病诊断方法，至今尚没有一种诊断方法能取代补体结合试验在血清学诊断中的地位。但补体结合试验所需要的溶血素的制备困难，试验操作繁琐，难以在临床上普遍使用，而且由于猪体内的补体会干扰豚鼠补体的作用，导致敏感性下降。ELISA是一种与CFT效果相当的诊断方法，该方法操作方便，灵敏度高，特异性较好，一次可以完成大量样品的检测，既可以作为筛选试验应用于动物群体检疫，还可以作为确诊试验。ELISA不仅可以应用于血清抗体的检测，还可应用于乳样中抗体的检测。牛的布鲁氏菌病ELISA检测方法已是国际贸易中指定的检测方法之一，其他种布鲁氏菌的ELISA检测方法也是研究的热点。目前，常用于羊布鲁氏菌病检测的血清学方法主要包括：试管凝集试验(STAT)、虎红平板凝集试验(RBPT)、补体结合试验(CFT)、布鲁氏菌竞争ELISA(cELISA)抗体检测试剂盒。除此之外，荧光偏振(FPA)诊断方法也逐步被应用于羊布病的诊断，该方法是一种利用免疫学和生物物理学原理开发的新型快速诊断方法，其基本原理是用荧光素标记抗原或者抗体，当抗原与特定抗体结合后，形成抗原/抗体复合物，分子量增大，使发射光激发荧光素分子后偏振角度减小，通过计算偏振程度的大小，判断血清是否为布鲁氏菌阳性血清。不同血清学诊断方法各有其优缺点，如何客观评价各种血清学诊断方法的特异性和敏感性评价，离不开具有一定规模、具有代表性的、背景清楚的血清样本库。本发明专利为羊布鲁氏菌参考血清库，为评价各种针对羊的布鲁氏菌病血清学诊断方法奠定了基础。技术实现要素：本发明的目的是通过收集或制备具有一定规模、一定代表性的、背景清楚的羊鲁氏菌不同感染状态(自然感染、疫苗免疫、健康)的山羊和绵羊的血清，经分装冻干和各种血清学检测，建成羊布鲁氏菌参考血清库，为布鲁氏菌病血清学诊断方法的科学评价提供参考血清。本发明的技术方案1.羊布鲁氏菌参考血清库，其特征在于含有自然感染的羊(包括绵羊和山羊)布鲁氏菌阳性血清30份以上；疫苗免疫的羊布鲁氏菌阳性血清30份以上(包括绵羊和山羊)；布鲁氏菌阴性血清30份以上；羊抗大肠杆菌O157血清、羊抗小肠结肠炎耶尔森氏菌O9血清、羊抗柏林沙门氏菌血清、羊粗糙型布鲁氏菌阳性血清各2份以上；本血清库可为各类羊布病血清学诊断方法的评价提供参考物质，其中：(1)血清库中各份血清均精确分装，并冻干保存。每份血清的冻干样本数大于10，满足不同时间使用的可重复性；(2)血清库中的布鲁氏菌阳性血清、布鲁氏菌阴性血清是指用虎红平板凝集试验、试管凝集试验以及补体结合试验等方法共同确认的血清；(3)大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森氏菌O9、柏林沙门氏菌、粗糙型布鲁氏菌阳性血清是易与布鲁氏菌抗体产生交叉反应，血清库中的羊抗大肠杆菌O157血清、羊抗小肠结肠炎耶尔森氏菌O9血清、羊抗柏林沙门氏菌血清、羊抗粗糙型布鲁氏菌阳性血清是用相应细菌培养物人工免疫绵羊制备而成，用以评价各种血清学诊断方法的特异性，属于质控阴性血清的一部分。2.权利要求1所述的羊布鲁氏菌参考血清库的应用，其特征在于使用该血清库中的参考血清能对各种羊布病血清学诊断方法的特异性和敏感性进行科学评价。本发明具体实施方式收集不同背景来源(自然感染、疫苗免疫、健康群体)的山羊和绵羊血清，经过虎红平板凝集试验(RBPT)初步检测，再经试管凝集试验(SAT)进行效价测定，以及补体结合试验(CFT)确诊，小量分装冻干后，分别作为羊布鲁氏菌阳性参考血清、羊布鲁氏菌疫苗免疫阳性参考血清、羊布鲁氏菌阴性参考血清。制备易干扰布病血清学诊断的其它革兰氏阴性菌的高免血清，主要包括羊抗小肠结肠炎耶尔森氏菌O9阳性血清、羊抗大肠杆菌O157阳性血清、羊抗柏林沙门氏菌阳性血清、羊抗粗糙型布鲁氏菌阳性血清。上述血清小量分装冻干后，作为羊布鲁氏菌特异性阴性参考血清(质控阴性血清)。将上述背景清楚、精确分装冻干的血清作为羊布鲁氏菌参考血清库，用于对羊布鲁氏菌病血清学诊断方法进行特性和敏感性评价。本血清库为各种羊布病血清学诊断方法评价提供了必要的物质基础。1.筛选临床上布病阳性的羊作为阳性血清样本来源。采用虎红平板凝集试验分别对山东地区有流产史的山羊场和内蒙地区有流产史的绵羊场进行布病抗体检测，对检测到的阳性血清，分别用试管凝集试验进行效价测定，同时用补体结合试验进行确诊。对确诊为布病阳性的羊，采集更多血清，并试管凝集试验重新测定效价。将各血清0.5ml/支分装冻干。2.跟踪监测免疫羊群抗体水平，采集血清作为免疫阳性血清样本来源。采用布病疫苗(S2株)对试验绵羊和山羊进行口服免疫，25亿CFU/头份。免疫完成后采用虎红平板凝集试验每周监测抗体水平，在抗体水平价高阶段收集部分羊的血清，按照临床阳性血清样本制备方法进行效价测定和补体结合试验确诊。将各血清0.5ml/支分装冻干。3.监测健康羊群布病抗体水平，采集抗体阴性羊的血清作为阴性血清样本来源。对未发生流产的羊场进行监测，选择虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验均检测为阴性的羊，制备阴性参考血清。将各血清0.5ml/支分装冻干。4.制备小肠结肠炎耶尔森氏菌O、大肠杆菌O157、柏林沙门氏菌、粗糙型布鲁氏菌等易与光滑型布鲁氏菌抗血清产生干扰的革兰氏阴性菌灭活抗原，免疫试验绵羊，制备相应的抗血清，作为特异性羊布鲁氏菌阴性血清样本来源。将各血清0.5ml/支分装冻干。5.建立上述各种血清的背景档案。本发明涉及生物材料资源信息小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia.enterocolitica)O9W22703株(徐云明等.区别检测小肠结肠炎耶尔森氏菌与布鲁氏菌LAMP引物的设计与分析,中国实验诊断学，2013年1月第17卷第1期，p19-22)来自吉林大学人兽共患病研究所；大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)O157(CVCC1489)、沙门氏菌都柏林血清型(Salmonellasp.serotypedublin)C79-86株(CVCC79351)和粗糙生物型布鲁氏菌(BrucellamelitensisBiotyperoughness)M111株(CVCC19)均来自中国兽医药品监察所国家兽医微生物菌种保藏管理中心(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p33、p75、p109)。本发明的积极意义本发明涉及一种羊布鲁氏菌参考血清库，本发明的意义在于：(1)在国际上率先建成了具有一定规模的羊布鲁氏菌参考血清库；(2)为布病诊断方法的科学评价提供了残酷物质；(3)为开发针对牛的各类布病诊断方法提供了物质基础。实施例以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。实施例1——临床阳性参考血清的制备1.采集临床山羊和绵羊血清各400余份，用虎红平板凝集试验进行初步测定。取待检血清0.03ml与等量的布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原(批号：200901)，作平板凝集，于4分钟内观察反应结果。结果虎红试验检测到的阳性血清共144份，其中山羊63份，绵羊81份。2.对144份虎红检测为阳性的样本进一步用试管凝集试验测定布鲁氏菌抗体效价，保留抗体效价在1﹕100以上的血清样本，进一步进行补体结合试验。具体操作如下：将试管凝集抗原(201501批)用0.5％苯酚生理盐水(简称：石盐水)作1:20稀释；将待检血清分别作1:25、1:50、1:100、1:200稀释。具体方法是：第一个管先加入2.4mL石盐水，以后每管都加入0.5mL石盐水，向第一个试管加入0.1mL血清混匀后取0.5mL加到第二个试管中作1:1稀释。以后各管类推。第一个试管应弃去1.5ml稀释血清；将20倍稀释的布鲁氏菌试管凝集试验抗原0.5mL分别加入各个血清试管内，摇匀，放37℃24h观察结果。最后血清的稀释度为1:50、1:100、1:200、1:400，同时按表1设立比浊管。试验设阳性血清(201501批)、阴性血清(201501批)和抗原对照(见表1)。表1试管凝集试验比浊管配制及透明程度表示管号稀释菌液(mL)生理盐水(mL)透明程度10.001.00++++20.250.75+++30.500.50++40.750.25+51.000.00-结果判定：在对照成立的前提下判定结果。待检血清效价在1:100(++)以上者为阳性；1:50(++)为可疑，以下为阴性。结果144份阳性血清中，共监测出119份试管凝集试验效价高于1：100的血清样本。其中山羊51份，绵羊68份。3.将虎红平板凝集试验和试管凝集试验检测均为阳性的113份血清，均用生理盐水作1:10稀释，于56℃灭能30min后，按表2进行补体结合试验操作。最后一次水浴加温20min后，按表3配制标准溶血管，并进行结果判定。结果119份阳性血清中，补体结合试验共检测112份阳性血清，其中山羊49份，绵羊63份。表2补体结合试验各试剂加样量及操作程序表3标准溶血管配制及判定标准实施例2——疫苗免疫血清的制备跟踪监测免疫羊群抗体水平，采集血清作为免疫阳性血清样本来源。采用布病疫苗(S2株)对试验绵羊和山羊进行口服免疫，25亿CFU/头份。免疫完成后采用虎红平板凝集试验每周监测抗体水平，在抗体水平价高阶段收集部分羊的血清，按照临床阳性血清样本制备方法进行效价测定和补体结合试验确诊。将各血清0.5ml/支分装冻干。实施例3——144份血清采用三种不同检测方法测定的结果。对144份(其中山羊63份，绵羊81份)经虎红初筛为阳性的血清，进一步进行试管凝集试验和补体结合试验检测，筛选三种方法均检测为阳性的血清作为各阳性血清样本，进行冻干。三种不同方法对144份血清的检测结果如下(表4)：表4临床采集的羊布病阳性血清采用三种不同检测方法测定的结果注：1.RBT：虎红平板凝集试验，取待检血清0.03ml与等量的布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原(批号：201501)，作平板凝集，于4分钟内观察反应结果。++++：出现大的凝集片或颗粒，液体完全透明；+++：有明显的凝集颗粒，液体几乎完全透明；++：有较明显的凝集颗粒，液体稍透明；+：稍能见到凝集，液体混浊；—：无凝集，液体均匀混浊。2.SAT：试管凝集试验，取待检血清经0.5％苯酚生理盐水分别:25、1:50、1:100、1:200稀释，与布鲁氏菌试管凝集试验抗原(批号：201501)，进行反应，37℃作用22～24小时，判定结果。4+：菌体完全凝集和沉淀，液体100％清亮；3+：菌体几乎完全凝集和沉淀，液体75％清亮；2+：有显著的凝集和沉淀，液体50％清亮；1+：有清楚可见的凝集和沉淀，液体25％清亮；—：无凝集和沉淀，液体菌液混浊。3.CFT：补体结合试验；P：阳性；N：阴性。4.布病阳性血清对照：2015-1批，装量：1ml，有效期至2025年3月26日，来自中国兽医药品监察所布病实验室。5.布病阴性血清对照：2015-1批，装量：1ml，有效期至2025年5月9日，来自中国兽医药品监察所布病实验室。6.“S”表示来自绵羊的血清样本；“G”表示来自山羊的血清样本；“/”表示未检测。实施例4——易与布鲁氏菌抗血清产生交叉的布鲁氏菌阴性参考血清(质控阴性血清)的制备和质量检验1.大肠杆菌O157灭活抗原、都柏林沙门氏菌灭活抗原、小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和粗糙型布鲁氏菌M111灭活抗原的制备(1)大肠杆菌O157灭活抗原的制备将复苏的大肠杆菌O157单个菌落接种到装有100ml普通肉汤(培养基)的三角烧瓶中，37℃摇振培养12-18h。10000r/min离心10min收集菌体。用10mlPBS重悬菌体，加入50μl福尔马林溶液，使甲醛含量为0.2％，置37℃灭活24h，中途摇晃3-4次。(2)都柏林沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌O9采用的培养基，抗原灭活方法与大肠杆菌O157一致；粗糙型布鲁氏菌M111采用的培养基为胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)，抗原灭活方法与大肠杆菌O157一致。(3)抗原的灭活检验：100μl涂布LB固体培养基，置37℃培养18h，观察有无细菌生长，如果仍有细菌生长表示灭活不完全，需要继续摇振灭活。若如细菌生长，表示灭活完全。2.免疫抗原制备(1)取少量大肠埃希氏菌CVCC1489株的O157灭活抗原用无菌生理盐水稀释至麦氏比浊管相同浊度，参照麦氏比浊管说明，此时细菌浓度约为8×108CFU/ml，根据稀释比例，计算灭活菌液原始浓度。据此，将制备的原始抗原调整至1×1010CFU/ml，作为免疫用抗原，2～8℃保存备用。(2)同上法将少量柏林沙门氏菌CVCC79351株灭活抗原稀释至麦氏比浊管相同浊度，参照麦氏比浊管说明，此时细菌浓度约为1×109CFU/ml，根据稀释比例，计算灭活菌液原始浓度。据此，将制备的原始抗原调整至4×1010CFU/ml，作为免疫用抗原，2～8℃保存备用。(3)同上法将少量小肠结肠炎耶尔森氏菌W22703株O9灭活抗原稀释至麦氏比浊管相同浊度，参照麦氏比浊管说明，此时细菌浓度约为8×108CFU/ml，根据稀释比例，计算灭活菌液原始浓度。据此，将制备的原始抗原调整至4×1010CFU/ml，作为免疫用抗原，2～8℃保存备用。(4)同上法将少量粗糙型布鲁氏菌M111株的灭活抗原稀释至麦氏比浊管相同浊度，参照麦氏比浊管说明，此时细菌浓度约为3×109CFU/ml，根据稀释比例，计算灭活菌液原始浓度。据此，将制备的原始抗原调整至1×1010CFU/ml，作为免疫用抗原，2～8℃保存备用。2.免疫免疫一般只需进行两次。初免：用2ml灭活抗原(1×1010CFU/ml)颈部皮下免疫布病阴性羊。加强免疫：初免3个月后，双倍剂量颈部皮下加强免疫1次。加强免疫后2周采血，用试管凝集试验测定凝集效价应不低于1:200。若效价达不到标准，继续加强免疫1～2次，15日后再试血，直至效价合格。3.血清制备二免14日后采血测定试管凝集效价，若效价满足要求，则颈静脉采血，分离血清，用0.45μm滤器过滤除菌，加入proclin300至终浓度为0.05％，无菌分装冻干。4.检验对制备完成的布鲁氏菌特异性质控阴性血清按如下项目进行检验：(1)性状观察各冻干制品色泽，加入1ml蒸馏水观察其溶解性。(2)无菌检验按《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一〇年版三部，中国农业出版社，2011，以下称《中国兽药典》)附录进行检验。(3)特异性检验1)对布鲁氏菌的特异性将各质控阴性血清分别作为待检血清，用布鲁氏菌cELISA抗体检测试剂盒进行检测，计算PI，均应低于30％。2)对相应病原的特异性4份质控阴性血清(SN1～SN4)各作1:100稀释，分别相应的灭活抗原(浓度为2×109CFU/ml)进行试管凝集试验，应判为阳性。实施例5.——布鲁氏菌特异性阴性质控血清质量检验结果参照实施例4制备各布鲁氏菌特异性阴性质控血样，其中SN1、SN2、SN3和SN4号分别表示免疫大肠杆菌O157灭活抗原、都柏林沙门氏菌灭活抗原、小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和粗糙型布鲁氏菌灭活抗原制备的抗血清。阴性质控血清，分装冻干后。抽取血清样本进行检验，结果如下：1.性状均为淡黄色疏松团块，加入1ml蒸馏水后能迅速溶解。2.无菌检验随机各抽取5瓶阴性血清，用1ml无菌蒸馏水复溶后，全部转移到50ml的硫乙醇酸盐(T.G)小瓶中，混匀后至37℃培养箱中培养3日后，从T.G小瓶中吸取0.2ml培养物分别接种T.G小管和G.A斜面各2支，1支置25℃培养，另一支置37℃培养；另取0.2ml接种一支G.P小管，置25℃培养，以上试管均培养5日。记录检验结果(见表5)。表5羊布病参考血清库中特异性阴性质控血清无菌检验结果“－”表示无菌生长；“+”表示有菌生长。3.特异性检验(1)对布鲁氏菌特异性采用竞争ELISA方法进行。将各质控阴性参考血清用布鲁氏菌cELISA抗体检测试剂盒进行检测，根据OD450值计算PI，低于30％为布鲁氏菌阴性血清。检测结果见表6。表6布鲁氏菌质控阴性血清特异性检验结果(2)对相应病原的特异性从质控阴性血清SN1、SN2、SN3、SN4中各随机抽取3瓶血清，分别用1m无菌蒸馏水复溶，将各复溶血清用相应试管凝集试验抗原，进行试管凝集试验和结果判定，检验结果见表7。表7布鲁氏菌特异性阴性质控血清试管凝集效价检验结果结果说明：4+：菌体完全凝集和沉淀，液体100％清亮；3+：菌体几乎完全凝集和沉淀，液体75％清亮；2+：有显著的凝集和沉淀，液体50％清亮；1+：有清楚可见的凝集和沉淀，液体25％清亮；—：无凝集和沉淀，液体菌液混浊。2++:凝集强度介于3+与2+之间，但更接近2+；2+-:凝集强度介于2+与1+之间，但更接近2+。当前第1页1 2 3