本发明涉及食品检测技术领域，具体是一种食品中三聚氰胺的检测试剂盒。
背景技术：
三聚氰胺（Melamine），俗称密胺、蛋白精，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，为纯白色单斜棱晶体。三聚氰胺是一种用途广泛的有机化工原料，最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂的原料，还可以用作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。
食品工业上通常采用凯氏定氮法，通过测定氮含量来推算蛋白质含量，三聚氰胺的含氮量为66％，常被不法分子违法添加到食品中，以造成蛋白质含量达标的假象。
然而，这种添加三聚氰胺的食品不仅没有真正增加蛋白质的含量，其毒副作用反而会给我们的身体健康带来危害。由于三聚氰胺具有较强的黏性，进入人体后水解生成三聚氰胺，容易在体内吸附形成结石的草酸、鞣酸及钙等物质，并沉淀在泌尿系统中。长期摄入三聚氰胺会造成泌尿系统损害，会损害人体和动物的生殖、泌尿系统，产生肾、膀胱结石。
2008年，我国爆发了三鹿婴幼儿奶粉添加三聚氰胺的事件，该事件被曝光的起因在于食用了添加三聚氰胺奶粉的婴幼儿产生了肾结石病症。可见，三聚氰胺掺入乳制品的作法已经直接挑战食品安全，并威胁着我们的健康。因此，为了杜绝食品中添加三聚氰胺，需要一种针对食品中的三聚氰胺进行检测的方法。
现有的三聚氰胺检测方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、气相色谱-串联质谱法等。这些方法虽然能够实现三聚氰胺的精确检测，但其灵敏度、反应效率均有一定的不足。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种灵敏度更高、反应时间短的食品中三聚氰胺的检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种食品中三聚氰胺的检测试剂盒，包括：1）三聚氰胺校准品；2）三聚氰胺-羧基磁珠连接物试剂；3）酶结合物；4）化学发光底物；5）清洗液。
作为本发明进一步的方案：所述的三聚氰胺标准品的浓度梯度为0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、200ng/ml。
作为本发明进一步的方案：所述的三聚氰胺-羧基磁珠连接物试剂的主要成份是三聚氰胺偶联羧基磁珠连接物。
作为本发明进一步的方案：所述的羧基磁珠的粒径为2～3μm，表面活性基团为羧基（-COOH）。
作为本发明进一步的方案：所述的酶结合物的主要成份是碱性磷酸酶标记的三聚氰胺结合蛋白。
作为本发明进一步的方案：所述的化学发光底物的主要成份是(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐)。
所述的食品中三聚氰胺的检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1）配制三聚氰胺校准品；
2）将三聚氰胺连接到羧基磁珠上制备连接物，用磁珠缓冲液稀释连接物到一定浓度，制备出连接物试剂；
3）用酶标记三聚氰胺结合蛋白，制备酶结合物；
4）配制化学发光底物；
5）配制清洗液；
6）分装以上各试剂，组成成品。
作为本发明进一步的方案：所述的三聚氰胺校准品的配制，包括以下步骤：
1）校准品缓冲液的配制：称取5g Tris碱、9g氯化钠（NaCl）、0.6g Proclin-300，加入900ml纯化水，用2mol/L柠檬酸钠将pH值调节至7.2±0.1；加入5g兔血清白蛋白，定容至1000ml后复测pH值，使之处于7.2±0.1，0.22μm过滤后于2～8℃保存；
2）将三聚氰胺纯品粉末用校准品缓冲液溶解，配制成为1μg/ml的浓溶液，随后依次稀释出5个浓度，分别为：10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、200ng/ml；加上0点，共6个浓度的校准品梯度值。
作为本发明进一步的方案：所述的三聚氰胺-羧基磁珠连接物试剂的制备，包括以下步骤：
1）准确称取三聚氰胺5mg，溶解于纯水中，终浓度为2.5mg/ml，得到三聚氰胺溶液；
2）配制pH值7.0的25mmol/L的磷酸盐缓冲液：称取NaH2PO4·H2O 1.5g、Na2HPO4·2H2O 2.5g、氯化钠（NaCl）3g，加入900ml纯化水，用2mol/L柠檬酸钠或碳酸氢钠将pH值调节至7.0±0.1，定容至1000ml后复测pH值，使之处于7.0±0.1，0.22μm过滤后于2～8℃保存；
3）配制5mg/ml的磺基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷（SMCC），用二甲基亚砜（DMSO）溶解；
4）往三聚氰胺溶液中加入80μL的5mg/ml的磺基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷（SMCC）进行活化，20～22℃反应40分钟，反应过程中充分混匀；
5）量取10mg羧基磁珠，将羧基磁珠放置于磁架上静置2分钟，移除上清，用pH＝7.0的25mmol/L磷酸盐缓冲液洗涤三次后加入磷酸盐缓冲液保存，使磁珠浓度为20mg/ml；
6）将活化后的三聚氰胺溶液加入清洗后的羧基磁珠中，并将反应液中磁珠浓度调整为5mg/ml，20～22℃反应35分钟，反应过程中充分混匀；
7）配制磁珠缓冲液：称取12g Tris碱、9g氯化钠（NaCl）、0.5ml吐温-20、1g Proclin-300，加入900ml纯化水，用2mol/L柠檬酸钠将pH值调节至7.2±0.1；加入1g干酪素钠，定容至1000ml后复测pH值，使之处于7.2±0.1，0.22μm过滤后于2～8℃保存；
8）反应完成后移除上清，用25mmol/L磷酸盐缓冲液洗涤三次后加入1ml磁珠缓冲液进行保存；使用时用磁珠缓冲液稀释成浓度为0.03mg/ml的工作液。
作为本发明进一步的方案：所述的酶结合物的制备，包括以下步骤：
1）取碱性磷酸酶1.0mg，将浓度调整为6mg/ml；
2）称取5mg磺基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷（SMCC），用二甲基亚砜（DMSO）进行溶解，终浓度为15mg/ml，加入5μL至碱性磷酸酶中，20～22℃反应15分钟；
3）用分子筛层析法根据分子量的差别对反应混合物进行纯化，收集活化后的碱性磷酸酶溶液；
4）取纯品三聚氰胺结合蛋白0.5mg，加入活化后的碱性磷酸酶缓冲液中，2～8℃反应4小时，最后用分子筛层析法将酶标记的三聚氰胺结合蛋白提纯出来；
5）酶结合物缓冲液配制：称取12g三羟甲基氨基甲烷（Tris）、9g氯化钠（NaCl）、6g甘油、0.6g Proclin-300，加入900ml纯化水，用2mol/L柠檬酸钠将pH值调节至7.2±0.1；加入10g兔血清白蛋白，定容至1000ml后复测pH值，使之处于7.2±0.1，0.22μm过滤后于2～8℃保存；
6）将结合物用酶结合物缓冲液稀释至酶标记的三聚氰胺结合蛋白浓度为2μg/ml即为工作液。
作为本发明进一步的方案：所述的化学发光底物的配制，包括以下步骤：准确称取3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐（AMPPD）0.5g、三羟甲基氨基甲烷（Tris）18g、氯化钠（NaCl）100g、十六烷基三甲基氯化铵（CTAC）0.02g，纯化水定容至1000ml，调整化学发光底物溶液pH值为9.4±0.05。
作为本发明进一步的方案：所述的清洗液的配制，包括以下步骤：称取1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）、8.5g氯化钠（NaCl）、1g吐温-20，加入纯化水约900ml，混匀至各试剂溶解，用2mol/L柠檬酸钠溶液调整溶液pH值到7.8±0.1，补加纯化水定容至1000ml，过滤后混匀待用。
利用所述的食品中三聚氰胺的检测试剂盒进行检测的方法，步骤为：
（1）向平底试管中加入50μL样本或者校准品；
（2）向平底试管中加入50μL磁分离试剂；
（3）向平底试管中加入40μL三聚氰胺结合蛋白碱性磷酸酶结合物；
（4）将平底试管放置在涡旋混匀仪上混匀30秒，然后置于37℃反应20分钟；
（5）将平底试管放置在磁架上静置2分钟后倒掉上清，拍干，加入清洗液500μL，混匀20秒；
（6）重复步骤（5）两次；
（7）将拍干的平底试管放入免疫分析仪中进行检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过三聚氰胺与固相载体直接稳定连接的方法，既可保证与固相载体连接的稳定性、又能保证三聚氰胺分子得到充分暴露，同时还通过引入磁性微粒扩大有效反应面积，建立了灵敏度更高、反应时间更短的三聚氰胺化学发光免疫检测试剂盒，该试剂盒可适用于各种发光检测仪器。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例中，一种食品中三聚氰胺的检测试剂盒，包括：1）三聚氰胺校准品；2）三聚氰胺-羧基磁珠连接物试剂；3）酶结合物；4）化学发光底物；5）清洗液。三聚氰胺标准品的浓度梯度为0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、200ng/ml。三聚氰胺-羧基磁珠连接物试剂的主要成份是三聚氰胺偶联羧基磁珠连接物。羧基磁珠的粒径为2～3μm，表面活性基团为羧基（-COOH）。酶结合物的主要成份是碱性磷酸酶标记的三聚氰胺结合蛋白。化学发光底物的主要成份是(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐)。
所述的食品中三聚氰胺的检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1）配制三聚氰胺校准品，包括：校准品缓冲液的配制：称取5g Tris碱、9g氯化钠（NaCl）、0.6g Proclin-300，加入900ml纯化水，用2mol/L柠檬酸钠将pH值调节至7.2±0.1；加入5g兔血清白蛋白，定容至1000ml后复测pH值，使之处于7.2±0.1，0.22μm过滤后于2～8℃保存；将三聚氰胺纯品粉末用校准品缓冲液溶解，配制成为1μg/ml的浓溶液，随后依次稀释出5个浓度，分别为：10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、200ng/ml；加上0点，共6个浓度的校准品梯度值；
2）将三聚氰胺连接到羧基磁珠上制备连接物，用磁珠缓冲液稀释连接物到一定浓度，制备出连接物试剂，包括：准确称取三聚氰胺5mg，溶解于纯水中，终浓度为2.5mg/ml，得到三聚氰胺溶液；配制pH值7.0的25mmol/L的磷酸盐缓冲液：称取NaH2PO4·H2O 1.5g、Na2HPO4·2H2O 2.5g、氯化钠（NaCl）3g，加入900ml纯化水，用2mol/L柠檬酸钠或碳酸氢钠将pH值调节至7.0±0.1，定容至1000ml后复测pH值，使之处于7.0±0.1，0.22μm过滤后于2～8℃保存；配制5mg/ml的磺基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷（SMCC），用二甲基亚砜（DMSO）溶解；往三聚氰胺溶液中加入80μL的5mg/ml的磺基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷（SMCC）进行活化，20～22℃反应40分钟，反应过程中充分混匀；量取10mg羧基磁珠，将羧基磁珠放置于磁架上静置2分钟，移除上清，用pH＝7.0的25mmol/L磷酸盐缓冲液洗涤三次后加入磷酸盐缓冲液保存，使磁珠浓度为20mg/ml；将活化后的三聚氰胺溶液加入清洗后的羧基磁珠中，并将反应液中磁珠浓度调整为5mg/ml，20～22℃反应35分钟，反应过程中充分混匀；配制磁珠缓冲液：称取12g Tris碱、9g氯化钠（NaCl）、0.5ml吐温-20、1g Proclin-300，加入900ml纯化水，用2mol/L柠檬酸钠将pH值调节至7.2±0.1；加入1g干酪素钠，定容至1000ml后复测pH值，使之处于7.2±0.1，0.22μm过滤后于2～8℃保存；反应完成后移除上清，用25mmol/L磷酸盐缓冲液洗涤三次后加入1ml磁珠缓冲液进行保存；使用时用磁珠缓冲液稀释成浓度为0.03mg/ml的工作液；
3）用酶标记三聚氰胺结合蛋白，制备酶结合物，包括：取碱性磷酸酶1.0mg，将浓度调整为6mg/ml；称取5mg磺基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷（SMCC），用二甲基亚砜（DMSO）进行溶解，终浓度为15mg/ml，加入5μL至碱性磷酸酶中，20～22℃反应15分钟；用分子筛层析法根据分子量的差别对反应混合物进行纯化，收集活化后的碱性磷酸酶溶液；取纯品三聚氰胺结合蛋白0.5mg，加入活化后的碱性磷酸酶缓冲液中，2～8℃反应4小时，最后用分子筛层析法将酶标记的三聚氰胺结合蛋白提纯出来；酶结合物缓冲液配制：称取12g三羟甲基氨基甲烷（Tris）、9g氯化钠（NaCl）、6g甘油、0.6g Proclin-300，加入900ml纯化水，用2mol/L柠檬酸钠将pH值调节至7.2±0.1；加入10g兔血清白蛋白，定容至1000ml后复测pH值，使之处于7.2±0.1，0.22μm过滤后于2～8℃保存；将结合物用酶结合物缓冲液稀释至酶标记的三聚氰胺结合蛋白浓度为2μg/ml即为工作液；
4）配制化学发光底物，包括：准确称取3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐（AMPPD）0.5g、三羟甲基氨基甲烷（Tris）18g、氯化钠（NaCl）100g、十六烷基三甲基氯化铵（CTAC）0.02g，纯化水定容至1000ml，调整化学发光底物溶液pH值为9.4±0.05；本化学发光底物为针对碱性磷酸酶的环二氧乙烷类底物，需要在2～8℃条件下避光保存，用时缓慢混匀；
5）配制清洗液，包括：称取1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）、8.5g氯化钠（NaCl）、1g吐温-20，加入纯化水约900ml，混匀至各试剂溶解，用2mol/L柠檬酸钠溶液调整溶液pH值到7.8±0.1，补加纯化水定容至1000ml，过滤后混匀待用；
6）分装以上各试剂，组成成品。
利用所述的食品中三聚氰胺的检测试剂盒进行检测的方法，步骤为：
（1）向平底试管中加入50μL样本或者校准品；
（2）向平底试管中加入50μL磁分离试剂；
（3）向平底试管中加入40μL三聚氰胺BP碱性磷酸酶结合物；
（4）将平底试管放置在涡旋混匀仪上混匀30秒，然后置于37℃反应20分钟；
（5）将平底试管放置在磁架上静置2分钟后倒掉上清，拍干，加入清洗液500μL，混匀20秒；
（6）重复步骤（5）两次；
（7）将拍干的平底试管放入免疫分析仪中进行检测。
检测结果的判断：将所获得的标准品和样品发光强度值的平均值除以第一个标准（0标准）的发光强度值再乘以100，以抑制率为纵坐标，三聚氰胺浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。
相对发光强度（%）=RLU/RLU0，RLU是标准品或者样品溶液测定的发光强度，RLU0是空白（浓度为0的标准溶液）的发光强度值。
试剂盒的准确度和精密度
准确度是指测定值与真值间的符合程度，试剂盒准确度常用回收率表示。精密度又称可重复性，常用变异系数表示。
按照样品前处理方法，以1.0ng/ml、2.0ng/ml两个浓度的三聚氰胺分别对牛奶、奶粉样品进行添加回收，每种样品每个浓度测定5个平行，用三批试剂盒进行测定，计算样品的回收率及精密度。实验结果显示，牛奶样品中三聚氰胺的添加回收率范围在85.6～99.2%，奶粉样品中三聚氰胺的添加回收率范围在84.3～92.8%。批内和批间变异系数均小于10%。
试剂盒的特异性
以三聚氰胺作为标准，设三聚氰胺的交叉反应率为100%，用于抗体交叉反应性研究的药物均为与三聚氰胺结构或者功能相似的药物：三聚氰酸、三嗪、三嗪二胺。按试剂盒步骤操作，但加入的竞争物分别为不同的三聚氰胺类似物，制作抑制曲线，根据线性方程计算各竞争物50%抑制浓度（IC50）。交叉反应率（%CR）即为抗体对三聚氰胺的IC50与抗体对三聚氰胺竞争物的IC50之比的百分数。结果显示，各三聚氰胺类似物的交叉反应率均＜1%，说明该试剂盒具有良好的特异性。
本发明通过三聚氰胺与固相载体直接稳定连接的方法，既可保证与固相载体连接的稳定性、又能保证三聚氰胺分子得到充分暴露，同时还通过引入磁性微粒扩大有效反应面积，建立了灵敏度更高、反应时间更短的三聚氰胺化学发光免疫检测试剂盒，该试剂盒可适用于各种发光检测仪器。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。