一种细胞内Hg2+的荧光成像方法与流程

本发明属于环境监测、食品安全、医疗卫生、生命科学等领域，具体涉及一种生物体内或细胞内hg²⁺的荧光成像方法。

背景技术：

hg²⁺废水污染物是构成水环境污染的重要组成部分。排入水中的无极汞污染物不能被生物降解，而是参与食物链循环，可被微生物转化为毒性更强的有机汞，并在生物体内大量富集后经过食物链(尤其是鱼类)进入人体，严重威胁着人类的健康，可造成中枢神经系统、内分泌系统及脑部的损害，此外，它可能还会破坏人体免疫系统，甚至导致死亡。因此，迫切需要建立一种快速、灵敏、特异、准确的hg²⁺检测方法。

目前，hg²⁺的检测方法主要包括：分光光度法、原子吸收/发射光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法(icpms)、色谱法、光学及电化学法等，然而，相比于昂贵的仪器和试剂、繁杂的样品预处理、耗时的检测流程等，荧光探针法更适合于hg²⁺的检测，不但能够较好地满足方便、经济、快捷地检测要求，而且，还能够对生物体内或细胞内的hg²⁺实现原位、动态的实时检测，即实现对生物体内或细胞内hg²⁺的时空分辨。目前，国内外对于生物体内或细胞内hg²⁺的荧光检测与成像的研究并不多，现有技术主要采用传统有限的荧光染料进行成像研究，不但受到检测条件如介质、ph值的限制、共存物质的干扰作用等，更重要的是，检测与成像的灵敏度和选择性均有待于提高。

近年来，现代分子生物学技术及纳米新材料的发展为hg²⁺的高灵敏、特异性生物传感检测技术提供了新的思路和有利条件，涌现出许多新技术、新方法。作为金纳米粒子家族中的新生代，金纳米笼一经问世就引发了广泛的关注和研究。该纳米材料具有中空多孔的结构。与传统的纳米颗粒相比，金纳米笼的局域表面等离子共振峰位于近红外区700～900nm，该波段对于生物医学意义重大，尤其是对于细胞及活体研究。研究表明，包括hg²⁺在内的多种金属离子能够特异性地和核苷酸“桥连”，使之形成稳定的金属离子-碱基对。其中，hg²⁺能够和错配的dna碱基对t-t相互作用，形成稳定的t-hg²⁺-t碱基对，这种特性已在生物传感的设计与应用方面显示出巨大的潜力，为生物体内或细胞内hg²⁺的荧光检测及共聚焦荧光显微成像提供了新型、特异、高效的检测平台。采用表面正电荷修饰的金纳米笼作为纳米容器，利用富t单链dna与金纳米笼表面的静电作用构建生物传感器并将其用于生物体内或细胞内hg²⁺的荧光成像还未见文献报道。

技术实现要素：

为了克服现有技术存在的不足，针对基于富t单链dna-金纳米笼的生物传感器用于生物体内或细胞内hg²⁺的荧光成像技术未见报道，因此，本发明的目的：提供一种采用表面正电荷修饰的金纳米笼为载体、以罗丹明b为客体分子、以hg²⁺识别探针为分子门构建而成的生物传感器进行生物体内或细胞内hg²⁺的荧光成像的方法，该方法所采用的生物传感器具有设计巧妙、结构简单、性能稳定、细胞毒性小、细胞膜渗透能力强、胞内释放可控性强、对hg²⁺选择性好、在细胞内分散性好等诸多优点，将其作为生物体内或细胞内hg²⁺成像的生物传感器，可实现细胞内hg²⁺的检测及成像。将本发明提出的荧光成像方法用于细胞内hg²⁺的荧光显微成像，能够方便、快捷地实现细胞内hg²⁺的高灵敏、高准确度的荧光成像，具有选择性好、响应时间短、易于直接观测、便于实时监测等优点，可在生物体内或细胞内hg²⁺的检测、成像方面发挥重要作用，为生物体内或细胞内hg²⁺的荧光成像的基础研究和应用提供新的方法和技术。

本发明是通过以下技术方案实现发明目的的。本发明所采用的生物传感器是以金纳米笼作为纳米载体，利用其空心多孔的结构特性，在其内部装载客体分子如荧光分子罗丹明b，为了防止荧光分子的外泄，通过静电作用在其表面组装具有可生物相应的分子门；其中，所述的可生物相应的分子门是将hg²⁺识别探针，即富t单链dna通过静电作用组装到金纳米笼表面构建而成，具体可以通过在金纳米笼表面修饰一层聚阳离子的方法而将富t单链dna组装到金纳米笼表面，优选地采用聚二烯丙基二甲基氯化铵作为正电荷修饰剂。

优选地，所述的金纳米笼内部装载的荧光分子可以是罗丹明b。

一种采用表面正电荷修饰的金纳米笼为载体、以罗丹明b为客体分子、以富t单链dna为分子门构建而成的生物传感器进行生物体内或细胞内hg²⁺的荧光成像的方法，包括如下步骤：

(1)取适量hela细胞，以2000～3000转/min下离心5～10min，移除上清液；

(2)加入制备好的基于富t单链dna-金纳米笼的生物传感器，37℃恒温孵育10～30min后进行激光共聚焦扫描成像实验；

所述的基于富t单链dna-金纳米笼的生物传感器的制备方法，包括如下步骤：

(1)将聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液加入到金纳米笼的悬浮液中，室温振荡过夜；

(2)离心分离上述溶液后，将罗丹明b溶液加入到体系中，室温振荡过夜；

(3)将富t单链dna溶液加入到上述溶液中，室温振荡过夜，离心分离，即制得基于富t单链dna-金纳米笼的生物传感器；

所述的金纳米笼按文献方法获得(g.d.moon,s.w.choi,x.cai,w.y.li,e.c.cho,u.jeong,l.v.wangandy.n.xia.j.am.chem.soc.2011,133,4762–4765)。

本发明的有益效果：本发明提出的一种采用表面正电荷修饰的金纳米笼为载体、以罗丹明b为客体分子、以富t单链dna为分子门构建而成的生物传感器进行生物体内或细胞内hg²⁺的荧光成像的方法，不但能够方便、快捷地实现细胞内hg²⁺的高灵敏、高准确度的荧光成像，同时还具有选择性好、响应时间短、易于直接观测、便于实时监测等优点，可在生物体内或细胞内hg²⁺成像检测及应用方面发挥重要作用，同时也为细胞荧光成像的基础研究和应用提供新的方法和技术。本发明所采用的基于富t单链dna-金纳米笼的生物传感器具有设计巧妙、结构简单的优点，对hg²⁺选择性好、细胞毒性小、细胞膜渗透能力强、胞内释放可控性强、在细胞内的分散性好，作为活细胞内hg²⁺的荧光成像的生物传感器，可实现细胞内hg²⁺的特异性成像检测。该成像方法在环境检测、食品卫生、生命科学等领域具有较大的应用潜力和广阔的应用前景。

附图说明

图1采用基于富t单链dna-金纳米笼的生物传感器得到的细胞内hg²⁺的共聚焦荧光显微成像照片。

具体实施方式

以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

下面通过实施例具体地说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。

实验仪器：thz-82a气浴恒温振荡器(金坛市医疗器械厂)；kdc-160hr高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；leicatcssp5ii激光共聚焦扫描仪(德国莱卡公司)。

实验试剂：罗丹明b(上海阿拉丁试剂有限公司)；聚二烯丙基二甲基氯化铵(美国sigma-aldrich公司)；富t单链dna碱基序列：3’-tttgtttgttggccccccttctttctta-5’(上海生工生物工程股份有限公司)，pbs溶液为0.01m(ph7.4,na2hpo4-nah2po4)。

实施例1：

一种采用表面正电荷修饰的金纳米笼为载体、以罗丹明b为客体分子、以富t单链dna为分子门构建而成的生物传感器进行生物体内或细胞内hg²⁺的荧光成像方法，包括如下步骤：

(1)取适量hela细胞悬浮液，以2500转/min下离心10min，移除上清液；

(2)在细胞中加入hg²⁺溶液，孵育温度37℃，30min后离心，移除上清液；

(3)加入制备好的生物传感器的pbs溶液，37℃恒温孵育30min后进行激光共聚焦扫描成像实验；

(4)将孵育好的细胞置于共聚焦显微镜的载物台上，激发波长：559nm；接收波长：580-630nm。

得到的hela细胞的荧光成像照片如图1所示。

实施例2:

实施例1中所述的基于富t单链dna-金纳米笼的生物传感器的制备方法，包括如下步骤：

(1)将200μl浓度11.664mg/ml的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液加入到400μl金纳米笼的悬浮液中，室温振荡过夜；

(2)离心分离上述溶液后，将100μl浓度1.0×10^-5mol/l的罗丹明b溶液加入到体系中，室温振荡过夜；

(3)将10μl浓度1.0×10^-5m的富t单链dna溶液加入到上述溶液中，室温振荡过夜，离心分离，即制得基于富t单链dna-金纳米笼的生物传感器；

所述的金纳米笼按文献方法获得(g.d.moon,s.w.choi,x.cai,w.y.li,e.c.cho,u.jeong,l.v.wangandy.n.xia.j.am.chem.soc.2011,133,4762–4765)。

本发明将纳米技术、分子生物技术与细胞成像技术相结合，通过特异性的分子识别反应，可实现对细胞内hg²⁺的高灵敏、高选择性的荧光成像。本发明提出的荧光成像的方法采用表面正电荷修饰的金纳米笼为载体、以罗丹明b为客体分子、以富t单链dna为分子门构建而成的生物传感器进行生物体内或细胞内hg²⁺的荧光成像。将该生物传感器与细胞进行孵育后，通过细胞的内吞作用，即可使生物传感器进入细胞，细胞内如果有hg²⁺存在，则会发生hg²⁺与富t单链dna之间的特异性分子识别反应，即在t-hg²⁺-t的配位作用下，富t单链dna转变成类似发卡型的双螺旋结构，导致富t单链dna从金纳米笼表面脱离，使封堵笼孔的分子门被打开，孔内的荧光分子罗丹明b被释放出来，实现荧光分子在细胞内的可控释放。因此，利用该生物传感器，能够实现对细胞内hg²⁺的高灵敏、高选择性的荧光成像检测。

本发明的细胞内hg²⁺的荧光成像方法具有选择性好、可控性强、响应时间短、易于直接观测、便于实时监测等优点，本发明所采用的生物传感器与传统的荧光染料成像技术相比，具有对hg²⁺选择性好、细胞毒性小、细胞膜渗透能力强、胞内释放可控性强、在细胞内的分散性好等诸多优点。该成像方法在环境监测、食品卫生、生命科学等领域具有较大的应用潜力和广阔的应用前景。

序列表

sequencelisting

<110>青岛科技大学

<120>一种细胞内hg2+的荧光成像方法

<160>1

<210>1

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

attctttcttccccccggttgtttgttt28