本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测鹅细小病毒的ELISA抗体检测试剂盒。
背景技术：
1.ELISA诊断技术的原理：
酶联免疫吸附实验（ELISA）即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。
它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）；②酶标记的抗原或抗体（标记物）；③酶作用的底物（显色剂）。
测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。
其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。其方法简单，方便讯速，特异性强。
2. 小鹅瘟：
鹅细小病毒感染是由鹅细小病毒引起的一种高度接触性、急性、败血性传染病，主要侵害4周龄以内雏鹅和雏番鸭。传染性强，且死亡率高。雏鹅和雏番鸭以心肌炎、伪膜性肠炎、全身急性败血病变为特征。目前，此病每年都有不同程度地流行，仍为养鹅业和集约化养殖番鸭的国家中最主要的传染病之一，对水禽养殖业造成严重损失。1956年，我国学者方定一在江苏扬州首先发现了此病，并用鹅胚分离出世界上第一株禽细小病毒。
目前虽然有不少的检测方法，例如琼脂扩散试验和琼脂扩散抑制试验，中和试验和动物保护试验，直接免疫荧光诊断法，免疫酶斑点法（Dot-ELISA）但是在一些基层单位缺乏相应的实验设备无法在第一时间进行诊断从而造成很大的损失。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种能快速、准确作出检测的多肽抗原检测GPV抗体的ELISA试剂盒。
本发明包括GPV-VP3特异性多肽抗原包被的酶标板、阴性血清、阳性血清、抗体稀释液、用辣根过氧化物酶标记的抗鹅IgG酶标抗体、底物显色液、终止液：所述GPV-VP3特异性多肽抗原为以下三种BSA偶联多肽抗原中的至少任意一种：
GPV-VP3-1 BSA-CVTDEQEVAPTNGVGWKPYGKTVTNEQNTTTAPTSS；
GPV-VP3-2 LRKENSKRWNPEIQFTSNFSDRTSIC-BSA；
GPV-VP3-3 FKIFNVQVKEVTTQDQTKTIC-BSA。
以上三种偶联多肽抗原为利用GPV-VP3特异性多肽，采用体外人工合成方法取得的多肽抗原。本发明利用人工合成多肽作为抗原，以获得灵敏度高、特异性高、操作简单、并快速检测GPV抗体的ELISA检测试剂盒。本发明利用三种多肽抗原（均进行偶联）研制了GPV抗体ELISA检测试剂盒，证明该试剂盒能够快速（约10min完成测定）、准确地检测GPV病毒抗体，具有良好的特异性和较高的灵敏性。
本发明的有益效果：本发明采用GPV-VP3多肽抗原作为包被抗原，有效提高多肽与目标抗体的结合效率，从而显著提高可检测灵敏度，同时显著降低非特异背景读值，特异性高，本发明的GPV抗体的ELISA试剂盒具有操作简单、诊断速度快、在进行大规模检测中经济方便等优点，是一种便于普及的好方法，具有广泛的应用前景。采用本发明的ELISA检测试剂盒检测GPV抗体，降低了检测成本，有利于推广使用。
进一步的，本发明所述阳性血清为用抗体稀释液按照体积比为1∶50的比例将GPV-VP3多肽标准阳性血清稀释后取得的稀释阳性血清。
所述阴性血清为用抗体稀释液按照体积比为1∶50的比例将GPV-VP3多肽标准阴性血清稀释后取得的稀释阴性血清。
以上标准阳性、阴性血清用于评价试剂盒检测结果的有效性。
所述抗体稀释液为质量百分数为0.1%的BSA。以用于保持血清抗体的效价和稳定性，减少非特异性。
所述用辣根过氧化物酶标记的抗鹅IgG酶标抗体是用HRP保护液按体积比为1∶2000～5000比例稀释后的抗鹅IgG酶标抗体。保护液保护酶标抗体的稳定性和效价。
所述底物显色液为TMB。使阳性样本呈现不同深浅颜色，从而判定阳性的强弱。
所述终止液为质量百分数为0.1%的SDS或2M的H2SO4，使酶促反应终止。
所述GPV-VP3特异性多肽抗原包被的酶标板的制备方法是：取96孔酶标板，每孔100uL GPV-VP3特异性多肽抗原，4℃过夜包被，包被浓度为0.5ug/ml，用PBST洗涤液250uL/孔，洗涤2～4次拍干，用封闭液150ug/孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST 250ug/孔洗涤3次后拍干，放入真空袋，4℃抽真空保存。
具体实施方式
一、GPV-VP3特异性多肽抗原的制备方法：
1、利用GPV-VP3特异性多肽，体外人工合成作为抗原快速检测GPV的抗体，制备过程：
1）称取RINK树脂0.3g（取代度0.3mmol/g）于150mL的反应器中，用50mL的二氯甲烷（DCM）浸泡。
2）2小时后，用3倍RINK树脂体积的氮-二甲基甲酰胺（DMF）洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将RINK树脂抽干后待用。
3）向反应器中加入5mL质量百分数为20%哌啶的DMF溶液（哌啶的DMF溶液由哌啶和DMF以体积比1∶4混合组成），放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。然后用3倍RINK树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。
4）取少量树脂用茚三酮（九井水合茚三酮）法检测检（检A、检B各两滴，100℃反应1min），树脂有颜色，说明脱保护成功。
5）称取碳端第一个氨基酸，根据氨基酸计算所需质量（0.3*0.3*AA的分子量）mg和1-羟基-苯骈三唑（HOBT）13.5mg于10mL的离心管中，加入1mL的DMF将其溶解，然后加入0.05mL的N，N-二异丙基碳二亚胺（DIC）振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
6）2小时后，用3mL醋酸酐混合液（醋酸酐混合液配方：醋酸酐、DIEA和DCM的体积比为1∶1∶2）封头半小时，然后用3倍RINK树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。
7）向反应器中加入5mL 质量百分数为20%哌啶的DMF溶液（哌啶的DMF溶液由哌啶和DMF以体积比1∶4混合组成），放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。然后用DMF洗涤四次，然后抽干。
8）取少量树脂用茚三酮（九井水合茚三酮）法检测检（检A、检B各两滴，100℃反应1min），树脂有颜色，说明脱保护成功。
9）称取后面设计中需要的第二个氨基酸（0.3*0.3*AA的分子量*3）mg和HOBT 40.5mg于10mL的离心管中，加入1mL的DMF将其溶解，然后加入2.5mL的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
10）1小时后，取少量RINK树脂检测，用茚三酮法检测检（检A、检B各两滴，100℃反应1min），若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。
11）待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入10mL 质量百分数为20%哌啶的DMF溶液（哌啶的DMF溶液由哌啶和DMF以体积比1∶4混合组成），放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。
12）按照步骤9）至11）依次接上后面设计需要的氨基酸。
13）待接上最后一个设计需要的氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液（配方：由三氟乙酸、1，2乙二硫醇、3，异丙基硅烷和水以体积比为95∶2∶2∶1的混合比组成）将多肽从树脂上切割下来（合成完后每克RINK树脂加10mL切割液），并用冰乙醚（配方：由切割液和乙醚以体积比为1∶9的混合比组成）离心沉降四次。最后用HPLC分离纯化，再冻干，得到一定纯度的多肽。
2、GPV-VP3特异性多肽抗原的筛选：
通过DNAStar、Genebank、ProtScale等分析软件对GPV-VP3蛋白的抗原表位进行预测，确定天然抗原的氨基酸序列，然后寻找该肽段所针对的抗原决定簇，使用ELISA检测不同多肽与GPV抗血清的反应，最后选出具有良好反应的GPV-VP3特异性多肽抗原。
有效多肽段的选择和确定，通过DNAStar、Genebank、ProtScale等分析软件对GPV-VP3蛋白的抗原表位进行预测，确定天然抗原的氨基酸序列，然后寻找该肽段所针对的抗原决定簇（epitopes），使用ELISA检测不同多肽与GPV抗血清的反应，最后选出具有良好反应的以下三种多肽抗原（均用BSA进行偶联，偶联部位N、C端如下）：
GPV-VP3-1 BSA-CVTDEQEVAPTNGVGWKPYGKTVTNEQNTTTAPTSS；
GPV-VP3-2 LRKENSKRWNPEIQFTSNFSDRTSIC-BSA；
GPV-VP3-3 FKIFNVQVKEVTTQDQTKTIC-BSA。
二、GPV-VP3特异性多肽抗原包被的酶标板的制备：
取96孔酶标板，取上述任意一种GPV-VP3特异性多肽抗原包被（包被液为1.59gNa2CO3，2.93gNaHCO3溶于800mL双蒸水中，调节pH至9.6，并定容至1000mL，包被浓度为0.5ug/ml，一般按照5ug/mL浓度稀释），每孔100uL，4℃过夜包被。次日用PBST洗涤液250uL/孔，洗涤2～4次后拍干，用封闭液150ug/孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST 250ug/孔洗涤3次后拍干,放入真空袋，4℃抽真空保存。
三、组装试剂盒：
各试剂盒包括GPV-VP3特异性多肽抗原包被液包被的酶标板；阳性血清和阴性血清各1管，其中阳性血清为GPV-VP3标准阳性血清，阴性血清为GPV-VP3标准阴性血清；用辣根过氧化物酶标记的抗鹅IgG的酶标抗体1瓶，抗体稀释液1瓶；底物显色液1瓶；终止液1瓶。
其中，阳性血清为用抗体稀释液按照体积比为1∶50的比例将GPV-VP3标准阳性血清稀释后取得的稀释阳性血清。
阴性血清为用抗体稀释液按照体积比为1∶50的比例将GPV-VP3标准阴性血清稀释后取得的稀释阴性血清。
抗体稀释液为质量百分数为0.1%的BSA。
用辣根过氧化物酶标记的抗鹅IgG酶标抗体是用HRP保护液按工作浓度比例稀释后的抗鹅IgG酶标抗体。
底物液显色液为TMB。
终止液为质量百分数为0.1%的SDS或2mol/L H2SO4。
下举两种典型的试剂盒实施例：
实施例1：GVP抗体的ELISA试剂盒，通过以下方法制备：
1）选择上述任意一种GPV-VP3特异性多肽抗原用包被液按照5ug/ml的浓度稀释（包被液为1.59gNa2CO3，2.93gNaHCO3溶于800mL双蒸水中，调节pH至9.6，并定容至1000mL），然后将稀释的多肽抗原包被96孔酶标板，每孔100uL，4℃过夜包被，次日用PBST洗涤液250uL/孔，洗涤3次后拍干，用封闭液150ug/孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST 250ug/孔洗涤3次后拍干，放入真空袋中，加入干燥剂，抽真空，4℃保存。
2）抗体稀释液（AD）配制：称取1.0g BSA（0.1%BSA），加PBS至1000mL，4℃保存。
3）底物液显色液配制：4mL TMB（50mg TMB溶于10mL DMSO中），9.8g柠檬酸，1.2mL 30% H2O2加蒸馏水定容至1000mL，4℃避光保存。
4）终止液配制（2mol/L H2SO4）：双蒸水178.3mL，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7mL。
5）阴/阳性血清为用抗体稀释液按照1∶20～100体积比例将GPV-VP3多肽标准阴/阳性血清稀释后取得的稀释阴/阳性血清，1mL/管分装4℃保存。
6）酶标抗体制备：用HRP保护液与辣根过氧化物酶标记的抗鹅IgG体积比为1∶2000的比例稀释辣根过氧化物酶标记的抗鹅IgG，4℃保存。
7）试剂盒的组装：将多肽抗原包被的96孔酶标板1块、1mL/管的阴阳性血清各1管、12mL/瓶的抗体稀释液1瓶、12mL/瓶的酶标二抗1瓶、12mL/瓶的底物显色液1瓶、6mL/瓶的终止液1瓶、操作说明书一份组装成ELISA检测试剂盒。
实施例2：GPV抗体的ELISA试剂盒，通过以下方法制备：
1）选择上述任多种GPV-VP3特异性多肽抗原用包被液按照0.1ug/ml的浓度稀释（包被液为1.59gNa2CO3，2.93gNaHCO3溶于800mL双蒸水中，调节pH至9.6，并定容至1000mL），然后将稀释的多肽抗原包被96孔酶标板，每孔100uL，4℃过夜包被，次日用PBST洗涤液250uL/孔，洗涤3次后拍干，用封闭液150ug/孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST 250ug/孔洗涤3次后拍干，放入真空袋中，加入干燥剂，抽真空，4℃保存。
2）抗体稀释液（AD）配制：称取1.0g BSA（0.1%BSA），加PBS至1000mL，4℃保存。
3）底物液显色液配制：4mL TMB（50mg TMB溶于10mL DMSO中），9.8g柠檬酸，1.2mL 30% H2O2加蒸馏水定容至1000mL，4℃避光保存。
4）终止液配制（质量百分数为0.1%的SDS）：双蒸水100mL，逐滴加入SDS 0.1mL。
5）阴/阳性血清稀释：用抗体稀释液按照阳性血清/阴性血清与抗体稀释剂按体积比为1∶ 100稀释，1mL/管分装4℃保存。
6）酶标二抗配制：用HRP保护液与辣根过氧化物酶标记的抗鹅IgG体积比为1∶3000的比例稀释辣根过氧化物酶标记的抗鹅IgG，4℃保存。
7）试剂盒的组装：将多肽抗原包被的96孔酶标板1块、1mL/管的阴阳性血清各1管、12mL/瓶的抗体稀释液1瓶、12mL/瓶的酶标二抗1瓶、12mL/瓶的底物显色液1瓶、6mL/瓶的终止液1瓶、操作说明书一份组装成ELISA检测试剂盒。
四、检测应用：
1、采用以上实施例1试剂盒进行检测，方法如下：
1）多肽抗原包被液包被的96孔板中每孔内加入100uL已经稀释好的各样本，每个样品必须使用一个独立的枪头，每块板中阴阳性对照血清各设两孔，室温下孵育60分钟，将各孔的液体弃入废液缸内。
2）用微量移液器取洗涤液，洗涤96孔板，约250uL/孔，洗涤6次，最后一次加入洗涤液后浸泡洗涤5min，再将板中残留的洗涤液弃入废液缸内，然后用力扣拍到吸水纸上，注意应避免包被板孔干燥。
3）然后在每孔加入100uL辣根过氧化物酶标记的抗鹅IgG抗体，室温下孵育60分钟，将各孔的液体弃入废液缸内，同上洗涤。
4）每孔加入100uL TMB底物液，避光显色15分钟，每孔加入2M H2SO4 50uL终止液，使反应终止，轻震酶标板，使板内液体混匀。
5）使用酶标仪测定并记录样本和对照样本A450的吸收值，10min完成测定。本实验结果应符合下列条件阳性对照的平均值减去阴性对照的平均值必须大于0.15，阴性对照平均值（N）必须小于或等于0，抗体的阳/阴性通过计算样品与阳性对照（S/P）的比值进行判定，具体计算方法如下：
如果S/P值小于0.10，样品应判定为GPV-VP3抗体阴性（-）。
如果S/P值0.10-0.15之间判定为GPV-VP3抗体可疑（+/-），如果S/P值大于0.15，则判定为样品GPV-VP3抗体阳性（+）。
2、采用以上类同的方法，以实施例2试剂盒进行检测，结果类同1。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
<110>扬州大学
<120>一种多肽抗原检测小鹅瘟抗体ELISA试剂盒
<160>3
<210>1
<211>36
<212>RNA
<213>人工序列
<400>1
CVTDEQEVAP TNGVGWKPYG KTVTNEQNTT TAPTSS
<210>2
<211>26
<212>RNA
<213>人工序列
<400>2
LRKENSKRWN PEIQFTSNFS DRTSIC
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
FKIFNVQVKE VTTQDQTKTI C