一种基于对巯基苯胺修饰金纳米棒的食源性致病菌检测方法与流程

本发明涉及一种基于对巯基苯胺修饰金纳米棒的食源性致病菌检测方法，具体涉及以巯基苯胺修饰的金纳米棒颗粒作为增强基底，利用核酸适配体DNA与食源性致病菌竞争性与适配体结合导致核酸适配体构象变化，结合拉曼光谱技术实现食源性致病菌的快速、灵敏检测。

背景技术：

食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，对人类健康造成很大危害，是食品安全的重大隐患。常用的食源性致病菌分析方法目前主要有传统的微生物检验技术、分子生物学技术、仪器分析技术和免疫学技术。现有的这些分析方法虽各有优势，但都存在一定的局限性，或者前处理步骤复杂、时间长，或者仪器设备庞大昂贵等。鉴于申请人在材料、生物技术及拉曼技术等方面积累了良好的工作基础，本发明拟构建一套显微拉曼光谱系统，深入研究快速、灵敏的食源性致病菌检测方法，该方法适用于食品安全、环境监测等技术领域。

目前，利用核酸适配体DNA与食源性致病菌竞争性与适配体结合导致核酸适配体构象变化，结合拉曼光谱技术实现食源性致病菌的快速、灵敏检测鲜为报道。本发明作为一种新兴的食源性致病菌检测方法，实现了食源性微生物快速、灵敏检测分析。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种基于对巯基苯胺修饰金纳米棒的食源性致病菌检测方法，其灵敏度高、可靠性强、检测速度快，实现了食源性致病菌的检测分析，适用于食品安全、环境监测等技术领域。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案：以食源性致病菌为研究对象，以巯基苯胺修饰的金纳米棒颗粒作为增强基底，食源性致病菌核酸适配体通过强大的静电吸附作用吸附在巯基苯胺修饰的金纳米棒颗粒表面，从而保护金纳米棒颗粒在盐溶液环境下不发生聚集现象，然而，当核酸适配体互补DNA与食源性致病菌共同存在于检测溶液中时，由于核酸适配体互补DNA与食源性致病菌竞争性地与核酸适配体发生特异性结合，导致适配体构象严重变化，进而导致巯基苯胺修饰的金纳米棒颗粒在盐溶液中的聚集差异；通过自主搭建的显微拉曼光谱系统，测定上述混合溶液拉曼信号，得到不同浓度食源性致病菌存在时巯基苯胺染料的拉曼图谱，实现对食源性致病菌的定量检测，并在牛奶实际样品中进行方法可行性验证。该检测方法适用于食品安全、环境监测等技术领域。

上述的一种基于对巯基苯胺修饰金纳米棒的食源性致病菌检测方法，所制备金纳米棒是采用种子生长法，以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和含有双键的阴离子十二烷基苯基磺酸钠(SDBS)作为表面活性剂胶束模板，在可溶性金源、可溶性银盐、抗坏血酸、硼氢化钠共同存在的酸性条件下，经过陈化所得。同时，制备过程中，通过调节不同表面活性剂浓度，考察其对金纳米棒尺寸、形貌、长径比、光学性质对表面增强拉曼信号的影响。最终，将优化后金纳米棒的形貌、等离子体共振吸收(LSPR)进行表征。

上述的一种基于对巯基苯胺修饰金纳米棒的食源性致病菌检测方法，所搭建显微拉曼光谱系统是将拉曼光谱技术与显微成像技术的独特性质相结合，既可用于拉曼光谱检测研究，还可通过显微模块，用于微观领域的拉曼光谱同步分析，实现不同技术之间的优势互补，为食源性微生物快速检测提供优势平台。

上述的一种基于对巯基苯胺修饰金纳米棒的食源性致病菌检测方法，核酸适配体序列为：5’-SH-TAT GGC GGC GTC ACC CGA CGG GGA CTT GAC ATT ATG ACA G-3’。核酸适配体互补DNA序列为：5'-NH2-CAA CAC GTG CCC AAC-3'。

上述的一种基于对巯基苯胺修饰金纳米棒的食源性致病菌检测方法，采用圆二色谱表征核酸适配体与食源性致病菌特异性结合能力，以及核酸适配体互补DNA与食源性致病菌共同存在时导致核酸适配体构象变化现象。

上述的一种基于对巯基苯胺修饰金纳米棒的食源性致病菌检测方法，所述的食源性致病菌至少包含大肠杆菌、肉毒梭状芽孢杆菌、布鲁氏菌、空肠弯曲菌、沙门氏菌、志贺氏菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、霍乱弧菌等。

上述的一种基于对巯基苯胺修饰金纳米棒的食源性致病菌检测方法，该方法包括如下具体步骤：

1)食源性致病菌样本准备：首先将微生物的菌株分别接于Luria-Bertani培养基中于37℃培养24h，然后以转速5000g离心5min，弃上清液，并用超纯水清洗三次，分别重新分散于超纯水。最后将所获得的细菌菌液分别进行10倍梯度稀释，获得8个梯度的菌液储存备用，同时采用菌落平板计数法分别确定细菌具体的菌落数量。

2)增强基底制备：增强基底金纳米棒的合成是利用种子生长法，在十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(0.2M)胶束水溶液中加入硝酸银。混合物反应20min，直到颜色变成红葡萄酒。随后，将硫酸钠加入至混合溶液中进行进一步生长。最终，将硫化处理后的金纳米棒收集离心(9000转，30分钟)，用纯水洗三次，最后分散在超纯水中。取对巯基苯胺(100μL，1.2mM)与1mL制备金纳米棒混合，连续震荡反应5h，得到以对巯基苯胺修饰的金纳米棒颗粒增强基底。

3)拉曼光谱采集：首先，将优化后100μL 20mM氯化钠溶液及100μL 20mM核酸适配体溶液加入到上述制备的80μL对巯基苯胺修饰的金纳米棒混合物中，随后，将150μL核酸适配体互补DNA与不同浓度食源性致病菌依次分别加入至相同体积上述混合溶液中，37℃连续震荡反应3h，最终，分别取检测体系溶液300uL于96孔板中，利用所搭建显微拉曼光谱系统在800-930nm波长范围内进行拉曼光谱测定，在此，拉曼光谱的激光波长设定为785nm。

4)牛奶中食源性致病菌加标回收检测：利用加标回收结合本发明设计的检测方法实现液态牛奶样本中的食源性致病菌。检测前需要对样本进行预处理。首先取5ml牛奶于10℃，7000g转速下离心10min，弃去上层乳脂，将沉淀用超纯水稀释20倍，静置后将上清液用过滤器过滤，收集滤液。最后采用本试验设计方法检测牛奶样本中的食源性致病菌浓度，并与所添加的浓度作对比。

与现有的技术相比，本发明的优点在于：

本发明所制备金纳米棒是采用种子生长法，以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和含有双键的阴离子十二烷基苯基磺酸钠(SDBS)作为表面活性剂胶束模板，在可溶性金源、可溶性银盐、抗坏血酸、硼氢化钠共同存在的酸性条件下，经过陈化所得。同时，制备过程中，通过调节不同表面活性剂浓度，考察其对金纳米棒尺寸、形貌、长径比、光学性质对表面增强拉曼信号的影响。最终，将优化后金纳米棒的形貌、等离子体共振吸收(LSPR)进行表征。

本发明所所搭建显微拉曼光谱系统是将拉曼光谱技术与显微成像技术的独特性质相结合，既可用于拉曼光谱检测研究，还可通过显微模块，用于微观领域的拉曼光谱同步分析，实现不同技术之间的优势互补，为食源性微生物快速检测提供优势平台。

本发明涉及的一种基于对巯基苯胺修饰金纳米棒的食源性致病菌检测方法易于操作，灵敏度高，检测范围广、检测速度快，在食品安全、环境监测等技术领域广泛应用。

本发明涉及的核酸适配体序列为：5’-SH-TAT GGC GGC GTC ACC CGA CGG GGA CTT GAC ATT ATG ACA G-3’。核酸适配体互补DNA序列为：5'-NH₂-CAA CAC GTG CCC AAC-3'。

本发明采用圆二色谱表征核酸适配体与食源性致病菌特异性结合能力及核酸适配体DNA与食源性致病菌共同存在时导致核酸适配体构象变化现象。

本发明涉及的所述的食源性致病菌至少包含大肠杆菌、肉毒梭状芽孢杆菌、布鲁氏菌、空肠弯曲菌、沙门氏菌、志贺氏菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、霍乱弧菌等。

附图说明

图1为合成增强基底表征：(A)为金纳米棒透射电镜图；(B)为金纳米棒散射图；

图2为试验方法检测结果；(A)为试验检测的不同浓度鼠伤寒沙门氏菌拉曼光谱曲线；(B)为标准曲线。

具体实施方式

实施实例1

为了进一步验证本发明所述方法对食源性致病微生物进行检测，本发明实例，以鼠伤寒沙门氏菌为例，具体操作步骤如下：

(1)鼠伤寒沙门氏菌样本准备：首先将鼠伤寒沙门氏菌的菌株分别接于Luria-Bertani培养基中于37℃培养24h，然后以转速5000g离心5min，弃上清液，并用超纯水清洗三次，分别重新分散于超纯水。最后将所获得的细菌菌液分别进行10倍梯度稀释，获得8个梯度的菌液储存备用，同时采用菌落平板计数法分别确定细菌具体的菌落数量。

(2)增强基底制备：增强基底金纳米棒的合成是利用种子生长法，在十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(0.2M)胶束水溶液中加入硝酸银。混合物反应20min，直到颜色变成红葡萄酒。随后，将硫酸钠加入至混合溶液中进行进一步生长。最终，将硫化处理后的金纳米棒收集离心(9000转，30分钟)，用纯水洗三次，最后分散在超纯水中。取对巯基苯胺(100μL，1.2mM)与1mL制备金纳米棒混合，连续震荡反应5h，得到以对巯基苯胺修饰的金纳米棒颗粒增强基底。图1为合成增强基底表征：(A)为金纳米棒透射电镜图；(B)为金纳米棒散射图；

(3)拉曼光谱采集：首先，将优化后100μL 20mM氯化钠溶液及100μL 20mM核酸适配体溶液加入到上述制备的80μL对巯基苯胺修饰的金纳米棒混合物中，随后，将150μL核酸适配体互补DNA与不同浓度鼠伤寒沙门氏菌依次分别加入至相同体积上述混合溶液中，37℃连续震荡反应3h，最终，分别取检测体系溶液300uL于96孔板中，在800-930nm波长范围内进行拉曼光谱测定，在此，拉曼光谱的激光波长设定为785nm。图2为试验方法检测结果：(A)为试验检测的不同浓度鼠伤寒沙门氏菌拉曼光谱曲线；(B)为标准曲线；

(4)牛奶中鼠伤寒沙门氏菌加标回收检测：利用加标回收结合本发明设计的检测方法实现液态牛奶样本中的鼠伤寒沙门氏菌。检测前需要对样本进行预处理。首先取5ml牛奶于10℃，7000g转速下离心10min，弃去上层乳脂，将沉淀用超纯水稀释20倍，静置后将上清液用过滤器过滤，收集滤液。最后采用本试验设计方法检测牛奶样本中的食源性致病菌浓度，并与所添加的浓度作对比。

综上，本发明涉及一种基于对巯基苯胺修饰金纳米棒的食源性致病菌检测方法。该方法为：以食源性致病菌为研究对象，以巯基苯胺修饰的金纳米棒颗粒作为增强基底，食源性致病菌核酸适配体通过强大的静电吸附作用吸附在巯基苯胺修饰的金纳米棒颗粒表面，从而保护金纳米棒颗粒在盐溶液环境下不发生聚集现象，然而，当核酸适配体互补DNA与食源性致病菌共同存在于检测溶液中时，由于核酸适配体互补DNA与食源性致病菌竞争性地与核酸适配体发生特异性结合，导致适配体构象严重变化，进而导致巯基苯胺修饰的金纳米棒颗粒在盐溶液中的聚集差异；通过自主搭建的显微拉曼光谱系统，测定上述混合溶液拉曼信号，得到不同浓度食源性致病菌存在时巯基苯胺染料的拉曼图谱，实现对食源性致病菌的定量检测，并在牛奶实际样品中进行方法可行性验证。该检测方法适用于食品安全、环境监测等技术领域。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

SEQUENCE LISTING

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<170> PatentIn version 3.3

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