本发明涉及肿瘤特异性核酸分子诊断标志物，具体涉及一种血液微小核酸(microrna)大肠癌诊断分子组合。
背景技术：
：：大肠癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤，2015年发病人数大约37.63万，死亡人数大约19.10万，位居五大常见恶性肿瘤之列。随着诊疗措施的完善，早期大肠癌患者预后已有明显改观，ⅰ期患者术后五年生存率已超过90％。然而，当肿瘤进展至ⅳ期时五年生存率骤跌至8.1％。因此，早期诊断能够显著延长患者生存期，是大肠癌防治工作重要切入点。目前大肠癌诊断常见下列几种方法：①肠镜检查：是大肠癌确诊的“金标准”。但肠镜的频繁应用使得该种侵袭性检查相关的并发症发生风险逐渐增加，而且患者易存抵触心理而造成随访脱漏，因此限制了其应用。②粪便隐血试验：是消化道肿瘤筛检的重要手段，具有无侵袭性且简便快速等特点。临床应用发现fobt的敏感度和特异度均相对较低，对于早期患者诊断能力不足。另外，fobt还易受患者饮食、取材部位、反应时间等因素干扰，导致试验易产生假阳性及假阴性结果。③肿瘤标志物：癌胚抗原(carcino-embryonicantigen，cea)是一种常用的肿瘤标志物，用于大肠癌患者预后评判及术后复发监测。但单个分子诊断敏感度较低且存在较高的假阳性率。因此，探索新型大肠癌标记物以改善目前常规早期诊断体系具有重要临床价值。近来发现mirna在多种恶性肿瘤(包括肺癌、大肠癌、乳腺癌、甲状腺癌、食管癌等)早期诊断方面具有敏感度、特异度较高且无侵袭性等独特优势，因而有望成为一种新型诊断标志物。mirna为一类18-25bp的小分子非编码rna，在细胞核内转录成初级转录产物pri-mirna后，经过drosha酶催化生成前体mirna，最后在胞浆内由dicer酶剪切为成熟的mirna。在大肠癌多步骤、多阶段演变过程中常伴有大量mirna表达失调，而mirna表达失调主要通过作用于靶基因及调节下游相关信号通路，发挥促癌抑癌作用。尤为重要的是，部分表达失调的mirna分子在肿瘤发展早期阶段即可被检测出，提示其作为早期诊断标志物的可能性，而且mirna不仅存在于组织中，其还可稳定存在于外周血及体液当中。循环mirna(circulatingmirnas)即指在血清、血浆或全血中检测到稳定性较好的一类mirna。主要有两条来源路径：①凋亡或坏死的细胞释放；②部分细胞主动分泌。在大肠癌患者血液中一些差异性表达的mirna具有明显的“肿瘤源性”特征，即来自于肿瘤细胞的直接分泌。因此，肿瘤组织中表达失调的mirna能够直接反映到患者的血液中，而且mirna可以通过与蛋白质(argonaute-2或高密度脂蛋白)结合，或者通过微囊泡保护作用而免遭酶的降解。另外，不同于其他类型rna分子，mirna独特的发卡结构也能使其自身保持相对稳定。体外条件下，在室温条件放置24小时或反复多次冻融的血液标本，甚至保存10年以上的标本中，mirna仍具有良好的稳定性。因此，循环mirna相对稳定特征使其具备了充当诊断标志物的前提条件。随着“精准医学”理念的深入，肿瘤特异性核酸分子诊断标志物相关研究正值“黄金期”。作为新型标志物研究的热门领域，mirna标志物的研究思路通常先利用高通量测序或芯片鉴定候选分子，然后结合qrt-pcr的高灵敏度和特异度，进一步从组织样本或者血液(包括全血、血清或血浆)样本中，验证出大量具备诊断标志物属性的mirna分子，用于恶性肿瘤的诊断或预后评估。截止目前，已经发现数百条mirna分子可作为多种疾病的临床诊断、预后、药物治疗反应等标志物。(zanutto,s.,s.pizzamiglio,m.ghilotti,etal.,circulatingmir-378inplasma:areliable,haemolysis-independentbiomarkerforcolorectalcancer.britishjournalofcancer,2014.110(4):p.1001-1007.；yamadaa,horimatsut,okugaway,nishidan,honjoh,idah,kout,kusakat,sasakiy,yagim,higurashit,yukawan,amanumay,etal.serummir-21,mir-29a,andmir-125barepromisingbiomarkersfortheearlydetectionofcolorectalneoplasia.clincancerres.2015；21:4234-4242.)虽然大量新型的mirna标志物为大肠癌的早期诊断提供了新的路径，但是从临床实际出发，同时检测百余种mirna不仅成本较高而且其实验结果对疾病的判断及鉴别亦过于复杂，不便推广应用于临床。另外，由于不同研究机构鉴定的mirna标志物差异较大(faltejskova,p.,o.bocanek,m.sachlova,etal.,circulatingmir-17-3p,mir-29a,mir-92aandmir-135binserum:evidenceagainsttheirusageasbiomarkersincolorectalcancer.cancerbiomark,2012.12(4):p.199-204.)，且现已明确在不同种族群体中mirna表达谱存在明显差别，一些mirna分子的诊断价值仍然有待于在不同人群队列中进一步评估验证(mitchell,p.s.,r.k.parkin,e.m.kroh,etal.,circulatingmicrornasasstableblood-basedmarkersforcancerdetection.procnatlacadsciusa,2008.105(30):p.10513-8.)。因此,鉴定出符合我国大肠癌患者的特征性mirna标志物仍处于初步阶段，尚需要在中国人群中明确mirna标志物的临床诊断应用价值。另外值得注意的是，作为无侵袭性的血液诊断标志物，mirna以何种方式与传统临床常用标志物进行整合，仍然是未知的，故极大地限制了其临床应用于推广(cekaitel,eidepw,lindge,skotheimri,lothera,etal.,micrornasasgrowthregulators,theirfunctionandbiomarkerstatusincolorectalcancer.oncotarget.20167(6):6476-50)。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有mirna标志物临床运用局限，提供一种符合中国人群特征的新型且实用的大肠癌血浆microrna标志物的分子组合。具体为：提供2类新型的用于大肠癌的诊断胎源性血浆mirna分子标志物(mir-26b和mir-17)；提供1种用于大肠癌临床诊断的4种mirna诊断模型组合，其可稳定地在血浆中检测并可明显地区分大肠癌患者与健康对照组；提供1种新型诊断策略即将本发明4分子组合与传统诊断标志物cea相结合运用方法，本发明基于新型的microrna生物标志物模型，明显地提升了大肠癌现有标志物的诊断的敏感度与特异度，尤其是开拓了mirna分子在我国人群中的临床应用领域。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：第一方面，本发明涉及一种大肠癌血浆microrna生物标志物，所述生物标志物包括hsa-mir-15b、hsa-mir-17、hsa-mir-19a、hsa-mir-21、hsa-mir-24、hsa-mir-26b、hsa-mir-145、hsa-mir-592、hsa-mir-760中的一种或几种。所述生物标志物microrna生物学信息如表1所示。优选的，所述生物标志物包括hsa-mir-26b、hsa-mir-760、hsa-mir-24和hsa-mir-592。第二方面，本发明涉及一种本发明的大肠癌血浆microrna生物标志物在制备大肠癌诊断试剂中的用途。第三方面，本发明涉及一种大肠癌特异性的胎源性microrna生物标志物组合，包括序列如seqidno：3所示的hsa-mir-26b和序列如seqidno：4所示的hsa-mir-17。优选的，所述has-mir-26b用于评估大肠癌的分化程度、所在部位及肿瘤负荷。第四方面，本发明涉及一种包括四种mirna分子的大肠癌microrna生物标志物检测模型，所述mirna分子为hsa-mir-26b、hsa-mir-760、hsa-mir-24和hsa-mir-592；所述检测模型运用以下公式计算：logistic＝0.3353×mir-26b-0.0307×mir-760+0.2599×mir-24-0.1831×mir-592；公式中的mir-26b、mir-760、mir-24、mir-592分别表示相对应的mirnas的表达量。该检测模型不以获得疾病的诊断和治疗方法为目的；而是用于大肠癌的组织病理学(如肿瘤大小、所在部位、分化程度、淋巴结转移程度、远处转移、临床分期)的评估。第五方面，本发明涉及一种包括四种mirna分子的大肠癌鉴别用血浆诊断试剂盒，所述试剂盒包括特异性检测mir-26b、mir-760、mir-24和mir-592的试剂。第六方面，本发明涉及一种包括肿瘤标志物cea与四种mirna分子的大肠癌microrna生物标志物检测模型，所述mirna分子为hsa-mir-26b、hsa-mir-760、hsa-mir-24和hsa-mir-592；所述检测模型运用以下公式计算：logistic＝20.8574×cea+0.3327×mir-26b+0.2979×mir-24-0.1335×mir-592-0.2951×mir-760；公式中的mir-26b、mir-760、mir-24、mir-592分别表示相对应的mirnas的表达量。该检测模型不以获得疾病的诊断和治疗方法为目的；而是用于大肠癌的组织病理学(如肿瘤大小、所在部位、分化程度、淋巴结转移程度、远处转移、临床分期)的评估。第七方面，本发明涉及一种联合四种mirna分子与癌胚抗原分子的大肠癌鉴别用血浆诊断试剂盒，所述试剂盒包括特异性检测mir-26b、mir-760、mir-24、mir-592和癌胚抗原cea的试剂。表1microrna生物学信息名称序列号序号序列hsa-mir-15bseqidno：1mimat0000417uagcagcacaucaugguuuacahsa-mir-17seqidno：2mimat0000070caaagugcuuacagugcagguaghsa-mir-19aseqidno：3mimat0000073ugugcaaaucuaugcaaaacugahas-mir-21seqidno：4mimat0000530uagcuuaucagacugauguugahsa-mir-24seqidno：5mimat0000080uggcucaguucagcaggaacaghsa-mir-26bseqidno：6mimat0000083uucaaguaauucaggauagguhsa-mir-145seqidno：7mimat0000437guccaguuuucccaggaaucccuhsa-mir-592seqidno：8mimat0003260uugugucaauaugcgaugauguhsa-mir-760seqidno：9mimat0004957cggcucugggucugugggga与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1、本发明基本大样本验证明确9种适用于中国人群的大肠癌特异性诊断标志物，相对国际上报道的其他mirna标志物，具备有更高的人群特异性；其中，本发明首次提出大肠癌胎源性mirna-26b和mir-17分子为大肠癌血浆标志物诊断的特异性分子，相较于其他mirna分子标志物更可靠。2、本发明基于logistic回归分析法，对于经大样本量筛选得到的9种血浆microrna标志物，进行模型构建，并得出最优化单纯mirna诊断模型即：logistic＝0.3353×mir-26b-0.0307×mir-760+0.2599×mir-24-0.1831×mir-592；相较于单个mirna，其诊断效率明显提升，具有较高的敏感度和特异度；而且，相较于基于数百个分子的芯片，具备更可靠的临床可行性和实用性，而且成本较低更易于推广。3、本发明首次根据大肠癌患者临床病理相关数据分析，评价并将癌胚抗原cea纳入到模型中，进一步提升了诊断的敏感度与特异度，降低了假阳性与假阴性，更加符合临床运用实际。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1：筛选期(上海第十人民医院队列)中所述9种分子区分大肠癌能力；图2：验证期(上海第六医院队列)中所述9种分子区分大肠癌能力；图3：筛选期(上海第十人民医院队列)中所述4分子模型区分大肠癌能力；图4：验证期(上海第六民医院队列)中所述4分子模型区分大肠癌能力；图5：大肠癌人群中与健康人相比所述9种mirna分子存在差别示意图。具体实施方式下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。术语解释：微小核酸rna(microrna,mirna)是一类长度约为18-25nt的进化高度保守的、内源性非编码rna分子。其在细胞核内转录成初级转录产物pri-mirna后，经过drosha酶催化生成前体mirna，最后在胞浆内由dicer酶剪切为成熟的mirna。大肠癌患者的mirna表达谱与健康人群存在显著差别。通常在大肠癌多步骤、多阶段发生、发展过程中伴有大量mirna表达失调，失调mirna通过与靶mrna3’非编码区utr之间精确互补配对，并使靶mrna分子降解；或通过与mrna分子之间的非精确互补配对，参与调控mrna的表达水平作用于靶基因及调节下游相关信号通路，发挥促癌抑癌作用，进而影响着从分子到细胞再到组织水平的一系列生物功能。尤为重要的是，mirna不仅存在于细胞或组织当中，其还可稳定存在于外周血及体液当中。循环mirna(circulatingmirnas)即指在血清、血浆或全血中检测到稳定性较好的一类mirna。目前认为血液中游离的mirna主要有两条来源路径：①凋亡或坏死的细胞释放(包括血液细胞的裂解)；②部分细胞主动分泌。在大肠癌患者血液中一些差异性表达的mirna具有明显的“肿瘤源性”特征，即来自于肿瘤细胞的直接分泌。因此，肿瘤组织中表达失调的mirna能够直接反映到患者的血液中，而且mirna可以通过与蛋白质(argonaute-2或高密度脂蛋白)结合，或者通过微囊泡保护作用而免遭酶的降解。另外，不同于其他类型rna分子，mirna独特的发卡结构也能使其自身保持相对稳定。体外条件下，在室温条件放置24小时或反复多次冻融的血液标本，甚至保存10年以上的标本中，mirna仍具有良好的稳定性。因此，循环mirna相对稳定特征使其具备了充当诊断标志物的前提条件。实施例在本发明中，第一，本发明设计了多阶段、两中心、案例-对照研究用于鉴定大肠癌特异性血浆microrna标志物。主要是先通过系统性评估候选mirna诊断标志物，然后利用qrt-pcr检测的高度敏感性，从候选标志物分子中，对队列一中的大肠癌患者和健康志愿者之间二者差异进行初筛(如图1，3)。在此基础上，扩大样本量，从初筛得到的差异microrna中，对不同的队列二中的大肠癌患者和健康志愿者之间进行验证(如图2，4)。表2所测9种mirna在大肠癌诊断方面的临床价值由表2可知，本发明涉及的9种mirna分子标志物均能够明显地区分大肠癌患者与健康志愿者，可用于作为大肠癌检测标志物。由图5也可知，在大肠癌人群中与健康人相比所述9种mirna分子存在显著的差别。第二，将上述9个大肠癌诊断的mirna标志物与大肠癌患者的组织病理学(如肿瘤大小、所在部位、分化程度、淋巴结转移程度、远处转移、临床分期)进行分析评估，并发现检测血浆has-mir-26b能够进一步用于评估大肠癌的分化程度、所在部位及肿瘤负荷。表3所测9种mirna分子标志对大肠癌病人的疾病严重程度评估结果由表3可知，血液中mir-26b在肿瘤分化程度、肿瘤大小及肿瘤位置判断方面有显著意义。第三，将上述9个大肠癌诊断的mirna标志物通过二元logistic回归分析法，构建出能够用于大肠癌诊断的最佳检测模型，即logistic＝0.3353×mir-26b-0.0307×mir-760+0.2599×mir-24-0.1831×mir-592。当截断值取0.402时，该模型敏感度可达62.5％，特异度达73.75％，约登指数为0.363。与传统标志物相比，具备良好的鉴别能力。第四，将上述9个大肠癌诊断的mirna标志物与5种肿瘤标志物(cea、ca19-9、ca72-4、afp和ca-242)通过二元logistic回归分析法，进一步构建出能够用于大肠癌诊断的血液标志物最佳检测模型，即logistic＝20.8574×cea+0.3327×mir-26b+0.2979×mir-24-0.1335×mir-592-0.2951×mir-760。当截断值取1.442时，该模型敏感度可达70％，特异度达96.67％，约登指数为0.667。这表明表明本发明4分子组合能够与传统标志物互补结合，显著地提升检测准确度。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。sequencelisting<110>上海市第十人民医院<120>血液微小核酸大肠癌诊断分子组合<130>dag28645<160>9<170>patentinversion3.5<210>1<211>22<212>rna<213>hsa-mir-15b<400>1uagcagcacaucaugguuuaca22<210>2<211>23<212>rna<213>hsa-mir-17<400>2caaagugcuuacagugcagguag23<210>3<211>23<212>rna<213>hsa-mir-19a<400>3ugugcaaaucuaugcaaaacuga23<210>4<211>22<212>rna<213>has-mir-21<400>4uagcuuaucagacugauguuga22<210>5<211>22<212>rna<213>hsa-mir-24<400>5uggcucaguucagcaggaacag22<210>6<211>21<212>rna<213>hsa-mir-26b<400>6uucaaguaauucaggauaggu21<210>7<211>23<212>rna<213>hsa-mir-145<400>7guccaguuuucccaggaaucccu23<210>8<211>22<212>rna<213>hsa-mir-592<400>8uugugucaauaugcgaugaugu22<210>9<211>20<212>rna<213>hsa-mir-760<400>9cggcucugggucugugggga20当前第1页12当前第1页12