一种用于硝基多环芳烃的双功能整体柱的制备及高效液相色谱联用方法与流程

本发明涉及一种用于硝基多环芳烃的双功能整体柱的制备及高效液相色谱联用方法，属于分析化学领域和环境化学领域。

背景技术：

硝基多环芳烃是在20世纪70年代末在环境中发现的一类有机污染物，其主要来源于有机物质、生物质的不完全燃烧和大气中母体多环芳烃与大气介质(NO₂、NO₃、HNO₃等)通过光化学反应生成。硝基多环芳烃具有直接的致突变性和致癌性，虽然其在大气中浓度远低于多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)，但它们的变异活性却高出其母体PAHs的数十乃至数千倍。因此当携带有NPAHs的颗粒物进入到人体后会严重威胁着人体健康。根据颗粒物粒径的大小不同，可以到达人体的不同部位，如PM10可以到达人的支气管，而PM2.5则可以到达人的肺部。

目前，国际上对大气颗粒物中微量毒害有机物的研究主要集中在以苯并芘为代表的多环芳烃上，而对致癌、致突变活性更强的硝基多环芳烃的研究报道则较少。这主要是因为环境样品成分复杂，NPAHs在环境中浓度非常低。加上有性质相近而含量较高的PAHs的影响，使NPAHs的检测更为不易。虽然一些高感度检测方法，如气相色谱-质谱(GC/MS)和高效液相色谱-荧光检测(HPLC/FLD)也有一些对于环境样本分析应用，但是对于NPAHs来说，一般的分析方法响应值低，给准确分析带来了一定的难度。特别是对目前为止所发现的直接致突变性最强的1,3-,1,6-和1,8-二硝基芘(DNPs)的分析感度还是不足。因此在NPAHs的分析检测中，样品预处理的重要性尤其突出。

技术实现要素：

本发明针对现有研究现有方法的不足，提出了一种准确、灵敏检测硝基多环芳烃的方法，即管内整体柱还原-管内固相微萃取-高效液相色谱分离-激光诱导荧光检测方法。该方法采用嵌入载铂石墨烯的多孔聚合物整体柱作为硝基多环芳烃的还原柱和固相微萃取柱对目标化合物进行高效率还原和高效富集，经过毛细管色谱柱分离后，采用高灵敏度、低检测限的激光诱导荧光检测器进行检测。本方法对于三种硝基多环芳烃的还原效率在98.39％-118.30％之间，萃取回收率可达85％以上，并可实现三种还原产物的基线分离，分辨率达2.71，本方法可实现对于硝基多环芳烃的高灵敏度检测。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于硝基多环芳烃(1,3-二硝基芘、1,6-二硝基芘和1,8-二硝基芘)的双功能整体柱的制备及高效液相色谱联用检测方法，包括如下步骤：

步骤一.待测样品的还原：取1-10μg/mL的硝基多环芳烃样品的二氯甲烷溶液在压力驱动下完全流过双功能整体还原柱，同时在还原柱末端施加反压50psi-300psi，将还原柱放在加热板上，设置加热温度：50-200℃，收集流出液；

步骤二.样品的管内固相微萃取：取经步骤一收集的流出液，浓缩，然后制备成还原产物样品水溶液(氨基多环芳烃的水溶液)，在压力驱动下，流经双功能整体萃取柱，使还原产物样品留在萃取柱上，在萃取柱末端用一离心管收集萃取液；

步骤三.还原产物样品的解析：取解析剂，在压力驱动下，流经步骤二的萃取柱，并在萃取柱末端用一离心管收集流出的溶液；

步骤四.还原产物样品的检测：制备毛细管填充柱，搭建毛细管色谱系统，使用激光诱导荧光检测器对分离后的还原产物样品进行检测。

所述的检测方法，其中，步骤一中所述的驱动压力为200psi-500psi，还原柱末端施加的反压为50psi-300psi。

所述的检测方法，其中，步骤二及步骤三中驱动压力为100psi-500psi。

所述的检测方法，其中，步骤三中解析液的pH值为3.5-5.0、体积百分比浓度是60％-100％的甲醇水溶液。

所述的检测方法，其中，步骤一及步骤二中所述的所用的双功能整体柱的制备：采用原位光引发聚合的方法制备，具体方法为：将含有载铂石墨烯的预聚合溶液注入到内壁硅烷化的石英毛细管中，在紫外光催化反应箱中反应10-60min，即可得到所需整体柱；其中预聚合物溶液包含单体、交联剂、致孔剂、光引发剂和载铂石墨烯，单体和交联剂的质量比在4:1～2:3之间，单体和交联剂的总质量与致孔剂的质量比在3:2～2:3之间；优选光引发剂质量占单体、交联剂、致孔剂、光引发剂和载铂石墨烯总质量的3‰-7‰，载铂石墨烯质量占单体、交联剂、致孔剂、光引发剂和载铂石墨烯总质量的3‰-7‰；功能单体是甲基丙烯酸正丁酯，交联剂是乙二醇二甲基丙烯酸酯，致孔剂是N，N-二甲基甲酰胺和聚乙二醇6000(根据需要可以任意调节比例)，引发剂是安息香二甲醚。使用的为载铂石墨烯为纳米材料，石墨烯与铂前驱体的质量比是1:1～1:3。

所述的检测方法，其中，步骤四中使用的毛细管填充柱填料为Kaseisorb LC ODS 60-5色谱柱中的C18颗粒，使用毛细管色谱柱制柱机自制而成。

所述的检测方法，其中，步骤四中使用毛细管色谱系统由进样系统、分离系统、驱动系统和检测系统组成。由附图12可见，将盛有样品的离心管放入的压力腔中，在气流压力的驱动下，通过六通阀进入定量环中，然后切换六通阀阀位，由色谱泵驱动流动相将样品带入色谱柱中进行分离。最后，在分离柱末端由激光诱导荧光检测器检测分离结果。

本发明可以获得如下效果：

本发明提供了一种利用双功能整体柱进行还原、管内固相微萃取-高效液相色谱-激光诱导荧光检测技术联用检测硝基多环芳烃的方法。该方法采用双功能整体柱对硝基多环芳烃进行还原及前处理，经毛细管色谱柱进行色谱分离，最终利用高灵敏度、低检测限的激光诱导荧光检测器进行检测。将样品的还原、富集、分离及检测于一体，是一种检测大气环境中硝基多环芳烃的良好方法。

本发明中使用的双功能整体柱经光聚法制备的载铂石墨烯嵌入的甲基丙烯酸酯类多孔聚合物整体柱，石墨烯具有较大的表面积，可增加还原反应催化剂铂的负载量，提高还原效率，同时石墨烯可与许多有机物质存在π-π共轭作用，提高萃取柱的萃取容量，实现对于复杂样品的高效富集。

利用本发明中的双功能整体柱对样品进行还原、萃取之后，收集解析液，通过毛细管色谱柱分离后，经激光诱导荧光检测器可实现对于样品的高灵敏度检测，通过该色谱系统可实现三种二氨基芘的分离，分辨率为2.71，单位柱长的理论塔板数为2386.12块/米，理论塔板高度为83.82微米。

附图说明

图1是本发明双功能整体柱的800倍扫描电镜图。

图2是本发明双功能整体柱的4000倍扫描电镜图。

图3是本发明双功能整体柱中还原催化剂载铂石墨烯的透射电镜图。

图4是本发明还原实验装置图。

图5是本发明通过双功能整体柱还原1,3-二硝基芘的结果对比图。

图6是本发明通过双功能整体柱还原1,6-二硝基芘的结果对比图。

图7是本发明通过双功能整体柱还原1,8-二硝基芘的结果对比图。

图8是本发明中萃取试验装置图。

图9是本发明通过双功能整体柱萃取1,3-二氨基芘的结果对比图。

图10是本发明通过双功能整体柱萃取1,6-二氨基芘的结果对比图。

图11是本发明通过双功能整体柱萃取1,8-二氨基芘的结果对比图。

图12是本发明中二氨基芘的高效液相色谱-激光诱导荧光检测系统分离检测系统示意图。

图13是本发明中三种氨基芘样品经过高效液相色谱-激光诱导荧光检测系统分离检测后的结果图。

具体实施方式

为了使本领域人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1载铂石墨烯嵌入双功能整体柱的制备

本发明所述的双功能整体柱的制备方法按照以下步骤具体实施:

S1.毛细管的硅烷化

取外径360μm、内径100μm，30cm长的熔融石英毛细管，分别用1.0mol/L NaOH、超纯水、1.0mol/L HCl、超纯水冲洗内壁30min，然后再用丙酮冲洗20min，氮气吹干。处理后的毛细管注入50％(v/v)的3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯的丙酮溶液，避光反应12h，用丙酮冲洗20min，氮气吹干，得到硅烷化的毛细管。

S2.载铂石墨烯的制备

将5mg石墨烯分散在20mL乙二醇中，搅拌加热至140℃，缓慢滴加1mL 1％H₂Pt₆·6H₂O水溶液，恒温搅拌1h，冷却至室温，多次用乙醇洗涤并离心即可得到载铂石墨烯。

S3.紫外光聚合的方法制备双功能整体柱

称取300mg甲基丙烯酸正丁酯、200mg乙二醇二甲基丙烯酸酯、400mg N,N-二甲基甲酰胺、100mg聚乙二醇6000和5mg安息香二甲醚、5mg载铂石墨烯催化剂。将溶液振荡均匀，在50℃下超声30min，并通氮除氧10min。然后将预聚合溶液注入硅烷化后的100μm内径毛细管中，并用硅胶塞密封两端，放入紫外光催化箱中光聚合25min后，取出毛细管，拔下硅胶塞。最后把毛细管安装在色谱泵上，用甲醇溶液冲洗，以除去未反应的单体和致孔剂，即可得到嵌有催化剂的毛细管整体柱，用于柱上还原实验和萃取实验。

在每次使用前，均需要用甲醇冲洗活化该双功能整体柱。

本实施例制备的嵌入载铂石墨烯双功能整体柱的扫描电镜图如图1所示，图2是双功能整体柱局部高倍率扫描电镜图，从图中可以看到载铂石墨烯，图3是载铂石墨烯的透射电镜图，可以看出，铂在石墨烯上负载分布均匀，且负载量多。

二硝基芘的还原实验：

先将长30cm的双功能毛细管整体柱放到加热板上，加热到100℃并保持。设置推动压力300psi，反压100psi，使20μL 5μg/mL硝基多环芳烃样品的二氯甲烷溶液完全经过整体柱进行还原反应并流出。采集流出液，将其进行检测，分别与原硝基样品溶液和同浓度的氨基样品溶液对比峰高(检测条件相同)，检测还原效果并计算还原效率。

本实施例的还原实验装置图如图4所示，图5、图6和图7分别为1,3-二硝基芘、1,6-二硝基芘和1,8-二硝基芘的还原结果对比图。三种二硝基芘的还原效率如下表所示：

三种二硝基芘的还原效率

从上表可以看出，该双功能整体柱对于二硝基芘有很高的还原效率，三种二硝基芘的还原效率在98.39％-118.30％之间，还原后的样品由于溶剂的挥发而导致浓缩，导致所测样品的还原效率超过100％，但这仍在实验的误差范围之内，不影响最终实验结果。

二氨基芘的萃取实验，萃取试验具体实施步骤如下所示:

S1.活化：将萃取柱安装在色谱泵上，用甲醇冲洗萃取柱，进行聚合物表面的预处理；

S2.萃取：通过压力驱动使20μL 5μg/mL氨基多环芳烃样品水溶液完全进入萃取柱并流出，收集萃取后流出液；

S3.解吸：通过压力驱动使20μL pH＝4.5的80％的甲醇水溶液，完全进入萃取柱并流出，收集解吸后流出液；

S4.检测：将5μg/mL氨基多环芳烃样品溶液通过压力驱动入100μm空毛细管，LIF检测荧光信号，并用同样的检测条件依次检测萃取后流出液和解吸后流出液，通过对比解吸后流出液和原样品溶液的峰面积，计算出萃取效率。

图8是本发明中萃取试验的装置图，图9、图10和图11分别为1,3-二氨基芘、1,6-二氨基芘和1,8-二氨基芘的萃取试验结果图，以1,3-二氨基芘为例计算萃取效率可到84.28％，因此该双功能整体柱对二氨基芘具有较好的回收率。

二氨基芘的色谱分离检测：

本发明通过高效液相色谱与激光诱导荧光检测器的联用，来实现二氨基芘样品的分离检测(上述还原和萃取采用单一硝基多环芳烃或氨基多环芳烃，只是为了说明问题，完全可以是混合的硝基多环芳烃或氨基多环芳烃)。具体实施步骤如下：

首先在进行分离之前，毛细管的检测窗口需要与光学系统进行聚焦。切换六通阀，通过对小瓶子施加一个固定压力，使荧光素溶液(10μmol/L)在一个恒定的流速下通过毛细管(为了避免引起荧光猝灭)。通过检测窗口的位置调整X-Y-Z平台，并监测荧光信号。一旦达到最大信号，就锁定X、Y和Z平台的位置。

调焦完成后，将样品(2μg/mL的1,3-二氨基芘、1,8-二氨基芘和1μg/mL的1,6-二氨基芘的混合样品)放入密封的小瓶子中，小瓶子的盖子上开了几个通孔，并由垫片保持其密封性。将毛细管经过通孔插入到样品中，再通入一定压力的氦气到密封的小瓶子中，200psi压力下进样40s，切换六通阀，分离流动相在色谱泵的驱动下使二氨基芘混合样品流经分离填充柱实现分离，并最终到达检测窗口时被LIF所检测。

本发明中二氨基芘的色谱分离系统装置图如图12所示，图13展示了在最优色谱条件下(流动相：50％乙腈，pH＝4.3，流速为500nL/min)达到的分离色谱图，在该条件下，分辨率是2.71，单位柱长的理论塔板数为2386.12块/米，理论塔板高度为83.82微米。

以上对本发明实施例所提供的一种用于硝基多环芳烃的双功能整体柱的制备及高效液相色谱联用方法，进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的实施方式及所得产品的应用进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，均属于本发明的保护范围；综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。