一种异龙脑对映体的手性色谱分离分析方法与流程

本发明属于手性色谱分离技术领域，更具体地，涉及一种异龙脑对映体的手性色谱分离分析方法。

背景技术：

异龙脑(Isoborneol)是一种环状单萜类化合物，其化学名为1,7,7-三甲基双环[2.2.1]庚-2-醇，有两种对映异构体(见式I)，与龙脑(Borneol)互为差向异构体。研究表明，异龙脑具有良好的抗菌作用，能抑制或杀灭金黄色葡萄球菌、乙型溶菌性链球菌等5种常见细菌[华西药学杂志，1989，4(1):20-22]，对单纯疱疹病毒表现出双重杀病毒活性，0.06％异龙脑完全抑制病毒复制[Antiviral Research,1999,43(2):79-92]；还具有明显的抗炎作用，可显著地抑制蛋清引起的大鼠足跄肿胀、巴豆油引起的小鼠耳廓肿胀[华西药学杂志，1990，5(3):190-191]；还具有镇痛[中国药学杂志，1995,30(9):532-534；华西药学杂志,1989,4(1):23]和改善血脑屏障通透性的作用[广州中医学院学报，1994,11(1):37-39]。异龙脑还对6-羟基多巴胺引起的人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡表现出良好的保护效果[Cell Physiology and Biochemistry,2007,20(6):1019-1032]。

由于异龙脑的分子结构较简单，没有典型的生色基团，目前，对一些中药(如冰片、艾片等)或中药制剂(如复方丹参滴丸等)中的异龙脑含量测定通常采用高效液相色谱串联示差折光检测器或气相色谱法[中国发明专利申请CN 201510670954.8；天津药学，2016，28(2)：13-15；医药导报，2014，33(7)：944-946；中国药房，2012，23(5)：448-450]。这些文献都未提及异龙脑对映异构体的手性分离研究。

由于同一化合物的对映异构体在生理活性、药效、毒性、生物体内的分布与代谢过程等方面可能存在差异，如(S)-多巴可治疗帕金森症，而(R)-异构体则会给患者带来严重副作用，(S,S)-乙二胺二丁醇可用于治疗肺结核，(R,R)-异构体则可能导致失明。但由于对映异构体的物理化学性质非常相似，常规方法难以将其拆分，手性化合物的分析检测和分离纯化成为手性研究中的一个关键问题。2012年，王玉等首先采用手性毛细管柱气相色谱法同时测定冰硼散中异龙脑、左旋龙脑和右旋龙脑的含量，异龙脑的对映异构体在Cyclosil-B毛细管柱上得到一定的分离，但由于缺乏对照品，不能对色谱峰进行定位[中南药学，2012，10(1)：19-22]。迄今未见直接采用液相色谱柱对异龙脑的对映异构体进行手性分析分离的报道。因此，开发一种异龙脑对映异构体的HPLC手性分析分离方法显得尤为重要。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中针对异龙脑对映异构体手性分析分离技术的不足，提供了一种异龙脑对映异构体体的手性色谱分离分析方法。

本发明的技术目的通过以下技术方案实现：

本发明提供一种异龙脑对映异构体的手性色谱分离分析方法，将异龙脑溶于正己烷中，再采用多糖手性固定相进行液相色谱分离分析，流动相为正己烷和低级醇的混合溶液；采用旋光检测器对异龙脑进行检测；

所述多糖手性固定相为涂覆三(3，5-二甲基苯氨基甲酰化)纤维素手性固定相或三(4-氯-3-甲基苯氨基甲酰化)纤维素手性固定相；

所述流动相中正己烷和低级醇的体积比为90～99：10～1。

所述低级醇为碳原子数为2～4的一元直链醇或支链醇。

发明人发现，以正己烷和低级醇作为流动相，在上述多糖手性固定相上，能够很好地实现异龙脑对映异构体的手性色谱分离。

更优选地，所述多糖手性固定相为涂覆三(3，5-二甲基苯氨基甲酰化)纤维素手性固定相。

优选地，所述流动相中正己烷和低级醇的体积比为98～99：2～1。

更优选地，所述流动相中正己烷和低级醇的体积比为99：1。

优选地，所述低级醇为乙醇、正丙醇、正丁醇或异丙醇。

更优选地，所述低级醇为乙醇。

优选地，将异龙脑溶于正己烷中，异龙脑的浓度不大于5.0mg·mL^-1。控制异龙脑的浓度在不太高的范围内，能获得更高的分离度，达到更好的分析检测效果。

更优选地，异龙脑的浓度为2.3mg·mL^-1。

优选地，液相色谱分离分析中，色谱条件中流动相的流速为1.0mL·min^-1，进样体积为10μL。

优选地，采用旋光检测器进行分析检测。

由于异龙脑的结构较为简单，没有典型的生色团，发明人发现在紫外检测器上不能检测，故采用旋光检测器研究异龙脑的手性分离；

旋光检测器的灵敏度设为4.0mdeg，响应延迟设为“关(off)”，色谱柱柱温为10℃。

更优选地，一种异龙脑对映异构体的手性色谱分离分析方法，包括如下步骤：将异龙脑溶解在正己烷中，异龙脑的浓度为2.3mg·mL^-1，采用涂覆三(3，5-二甲基苯氨基甲酰化)纤维素手性固定相进行手性分离；所述流动相由正己烷和乙醇组成，其体积比为99：1；色谱条件中流动相的流速为1.0mL·min^-1，进样体积为10μL，采用旋光检测器进行分析检测。在上述色谱条件下，异龙脑对映异构体间的分离度为2.76，选择因子为1.27，实现基线分离。

同时，采用本发明所述的分离分析方法的固定相与流动相条件，扩大固定相的规格和进样量，能色谱制备得到高纯度的左旋异龙脑和右旋异龙脑产品。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明采用特定的多糖手性固定相，结合恰当比例的正己烷-乙醇作为流动相，对异龙脑对映异构体实现基线分离。本发明开发了一种全新的异龙脑对映异构体的HPLC手性分析分离方法，不仅可快速对异龙脑对映异构体进行手性分析，还可手性分离得到光学纯的异构体。在所选择的固定相和流动相的组合下，通过分析方法和制备工艺的调整，可以获得高分离度和高选择因子的效果，特别适用于小剂量样品的分析检测；在制备色谱上，也可以扩大进样量，得到高纯度的左旋异龙脑和右旋异龙脑产品。

附图说明

图1为本发明实施例1在涂覆三(3，5-二甲基苯氨基甲酰化)纤维素手性固定相、10℃下，正己烷-乙醇(99：1，v/v)为流动相、旋光检测器检测时异龙脑样品的HPLC谱图。

图2为本发明实施例2在涂覆三(3，5-二甲基苯氨基甲酰化)纤维素手性固定相、10℃下，正己烷-乙醇(95：5，v/v)为流动相、旋光检测器检测时异龙脑样品的HPLC谱图。

图3为本发明实施例3在涂覆三(3，5-二甲基苯氨基甲酰化)纤维素手性固定相、10℃下，正己烷-异丙醇(99：1，v/v)为流动相、旋光检测器检测时异龙脑样品的HPLC谱图。

图4为本发明实施例4在涂覆三(3，5-二甲基苯氨基甲酰化)纤维素手性固定相、10℃下，正己烷-乙醇(99：1，v/v)为流动相、旋光检测器检测时的(+)-异龙脑和(-)-异龙脑的HPLC谱图。

具体实施方式

下面通过实施例和附图对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例中，所用的涂覆三(3，5-二甲基苯氨基甲酰化)纤维素和涂覆三(4-氯-3-甲基苯氨基甲酰化)纤维素手性固定相由广州研创生物技术发展有限公司生产，也可以使用其它公司生产的产品。

异龙脑对映异构体手性色谱分析分离条件

1、手性固定相的筛选

仪器与条件：

高效液相色谱仪：安捷伦1200系列液相色谱仪

旋光检测器：IBZ Messtechnik GMBH Chiralyser-MP型旋光检测器

色谱柱(规格为250mm×4.6mm)：柱内分别填充广州研创生物技术发展有限公司生产的涂覆三(3，5-二甲基苯氨基甲酰化)纤维素手性固定相和涂覆三(4-氯-3-甲基苯氨基甲酰化)纤维素手性固定相，分别标记为Enantiopak OD和Enantiopak OX。

流动相：正己烷：乙醇＝99：1(v/v)

流速：1.0mL·min^-1

色谱柱柱温：10℃

进样体积：10μL

样品浓度：2.3mg·mL^-1

检测器设置：灵敏度设为4.0mdeg，响应延迟设为“关(off)”

表1异龙脑对映异构体在两款手性固定相上的手性分离结果

异龙脑对映体在手性色谱柱上的拆分分离结果见表1。异龙脑对映体在涂覆三(3，5-二甲基苯氨基甲酰化)纤维素手性固定相(Enantiopak OD)上的分离度显著大于在Enantiopak OX柱上。

2、醇类的选择

仪器与条件：

高效液相色谱仪：安捷伦1200系列液相色谱仪

旋光检测器：IBZ Messtechnik GMBH Chiralyser-MP型旋光检测器

色谱柱：Enantiopak OD色谱柱(250mm×4.6mm)

流动相：正己烷：醇＝99：1(v/v)

流速：1.0mL·min^-1

色谱柱柱温：10℃

进样体积：10μL

样品浓度：2.3mg·mL^-1

检测器设置：灵敏度设为4.0mdeg，响应延迟设为“关(off)”

结果见表2所示。在四种不同流动相中，以正丙醇为改性剂时，异龙脑对映体在Enantiopak OD柱的分离度最大，为3.07；以异丙醇或正丁醇为改性剂，异龙脑对映体在色谱柱上的容量因子和分离度都相近；而以乙醇为改性剂时，异龙脑对映体的分离度要好于以异丙醇或正丁醇为改性剂的流动相，但其容量因子更小，说明异龙脑对映体在Enantiopak OD柱的洗脱更快，可显著加快异龙脑分析分离的速度。后续工作中，选择乙醇为流动相的改性剂。

表2异龙脑对映体在四种流动相中的手性分离结果

3、流动相比例的选择

仪器与条件：

高效液相色谱仪：安捷伦1200系列液相色谱仪

旋光检测器：IBZ Messtechnik GMBH Chiralyser-MP型旋光检测器

色谱柱：Enantiopak OD色谱柱(250mm×4.6mm)

流动相：正己烷：乙醇＝99：1、98：2、95：5、90：10(v/v)

流速：1.0mL·min^-1

色谱柱柱温：10℃

进样体积：10μL

样品浓度：2.3mg·mL^-1

检测器设置：灵敏度设为4.0mdeg，响应延迟设为“关(off)”

结果见表3。随着流动相中乙醇的含量降低，异龙脑在Enantiopak OD色谱柱的保留增强，分离度逐渐增大。以正己烷与乙醇＝99：1(v/v)的混合液为流动相时，异龙脑对映体的分离度达到最大。

表3流动相比例对异龙脑手性分离的影响

4、异龙脑对映体的手性分析分离实例

实施例1异龙脑在Enantiopak OD色谱柱上的手性分析

以正己烷溶解异龙脑样品，配制成浓度为2.3mg·mL^-1的溶液；在串联IBZ Messtechnik GMBH Chiralyser-MP型旋光检测器的安捷伦1200系列高效液相色谱仪上，采用Enantiopak OD色谱柱(250mm×4.6mm)、以正己烷：乙醇＝99：1(v/v)为流动相、进样体积为10μL、流速为1.0mL·min^-1、色谱柱柱温为10℃、旋光检测器的灵敏度设为4.0mdeg，响应延迟设为“关(off)”的条件下对异龙脑样品溶液进行色谱分离。

如图1所示，分别在6.345min和7.315min观察到异龙脑的两种对映异构体的色谱峰，分离度为2.76。先被洗脱的异龙脑手性异构体旋光度为正值，后洗脱的异构体旋光度为负值。

实施例2异龙脑在Enantiopak OD色谱柱上的手性分析

以正己烷溶解异龙脑样品，配制成浓度为2.3mg·mL^-1的溶液；在串联IBZ Messtechnik GMBH Chiralyser-MP型旋光检测器的安捷伦1200系列高效液相色谱仪上，采用Enantiopak OD色谱柱(250mm×4.6mm)、以正己烷：乙醇＝95：5(v/v)为流动相、进样体积为10μL、流速为1.0mL·min^-1、色谱柱柱温为10℃、旋光检测器的灵敏度设为4.0mdeg，响应延迟设为“关(off)”的条件下对异龙脑样品溶液进行色谱分离。

如图2所示，分别在4.427min和4.613min观察到异龙脑的两种对映异构体的色谱峰，分离度为0.72。先被洗脱的异龙脑手性异构体旋光度为正值，后洗脱的异构体旋光度为负值。

实施例3异龙脑在Enantiopak OD色谱柱上的手性分析

以正己烷溶解异龙脑样品，配制成浓度为2.3mg·mL^-1的溶液；在串联IBZ Messtechnik GMBH Chiralyser-MP型旋光检测器的安捷伦1200系列高效液相色谱仪上，采用Enantiopak OD色谱柱(250mm×4.6mm)、以正己烷：异丙醇＝99：1(v/v)为流动相、进样体积为10μL、流速为1.0mL·min^-1、色谱柱柱温为10℃、旋光检测器的灵敏度设为4.0mdeg，响应延迟设为“关(off)”的条件下对异龙脑样品溶液进行色谱分离。

如图3所示，分别在6.691min和7.172min观察到异龙脑的两种对映异构体的色谱峰，分离度为2.41。先被洗脱的异龙脑手性异构体旋光度为正值，后洗脱的异构体旋光度为负值。

实施例4异龙脑对映体在Enantiopak OD色谱柱上的手性分离

以正己烷溶解异龙脑样品，配制成浓度为50mg·mL^-1的溶液；在串联IBZ Messtechnik GMBH Chiralyser-MP型旋光检测器的安捷伦1200系列高效液相色谱仪上，采用Enantiopak OD色谱柱(250mm×10mm)、以正己烷：乙醇＝99：1(v/v)为流动相、流速为1.0mL·min^-1、进样体积为50μL、柱温为10℃、色谱柱柱温为10℃、旋光检测器的灵敏度设为4.0mdeg，响应延迟设为“关(off)”的条件下对异龙脑进行手性分离。分别收集两种异龙脑异构体的溶液。经蒸发溶剂、干燥后分别得到左旋和右旋异龙脑样品；最后，采用实施例1所述方法分别对两种异龙脑的异构体样品进行色谱分析。

如图4所示，右旋异龙脑样品在6.536min出现一个正峰，左旋异龙脑7.327min出现一个负峰。采用面积积分法计算可知，右旋异龙脑和左旋异龙脑的纯度均大于99％。