本发明属于表观遗传生物学技术领域，具体涉及一种高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法。
背景技术：
表观遗传是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化。组蛋白修饰是表观遗传调控的重要手段之一。组蛋白是染色质的主要成份之一，其氨基端的氨基酸残基可以被共价修饰，如甲基化、乙酰化、泛素化和磷酸化修饰，这些修饰可以直接改变组蛋白与组蛋白及组蛋白与DNA的相互作用，或者通过招募一些具有特定功能的蛋白或蛋白复合物调控基因表达。组蛋白修饰除了简单地调控基因表达，更在于它可以招募蛋白复合体，影响下游蛋白，从而参与细胞分裂、细胞凋亡和记忆形成，甚至影响免疫系统和炎症反应等。同时，研究表明，组蛋白修饰与CTD密码、生物节律、DNA修复之间也存在一定的联系。
组蛋白修饰调控基因表达的一个重要手段是招募其它蛋白或蛋白复合物来启运下游的生物学过程。这些蛋白或蛋白复合物与组蛋白修饰位点之间的相互作用通常是通过一些特定的结构域来实现的。这些结构域通常具有很高的保守性，而且同一类结构域能识别不同的组蛋白修饰位点或同一位点的不同修饰状态；另一方面，同一个组蛋白修饰位点又能够被多个不同结构域所识别(Taverna,S.D.,Li,H.,Ruthenburg,A.J.,etal(2007)Howchromatin-bindingmodules interpret histone modifications:lessons from professional pocket pickers,Nat Struct Mol Biol14,1025-1040)。同一个甲基化位点被不同结构域识别或者同一个结构域识别不同甲基化位点可能启动不同的下游生物学过程。
研究蛋白质相互作用的方法很多，目前较普遍的生物学方法包括：免疫共沉淀、GST-pull down、FarWestern分析、噬菌体展示和酵母双杂交等(Fields S,SongO.Anovel genetic ayaterm to detect protein-protein interactions.Nature,1989,340(6230；245-246)。这些技术的发展为蛋白质相互作用的研究提供了非常有效的手段。然而，免疫共沉淀、GST-pulldown、FarWestern分析都是针对某一种蛋白质相互作用的分析和鉴定，远远无法满足蛋白质组学研究中高通量的要求；噬菌体展示和双酵母双杂交技术虽然可以对蛋白质相互作用进行大规模的筛选，但噬菌体展示技术更适合筛选较短的肽段，而较大蛋白质分子由于很难得到噬菌体展示库，因此对于筛选与其相互作用的蛋白质有很大局限性；酵母双杂交是检验在细胞内蛋白质与蛋白质的相互作用的一种方法，它的局限性在于所研究的蛋白质必须能够进入细胞核同时该蛋白质不是细胞核转录调控因子。
高通量技术具有高效的特点，与现有技术相比，其可实现大规模高通量的筛选与组蛋白修饰相结合的蛋白质或蛋白质复合物。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服上述现有技术存在缺陷而提供一种高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法。具体方法包括(1)将组蛋白修饰多肽固定在载体上，制备组蛋白修饰芯片；(2)待筛选蛋白质混合物与组蛋白修饰芯片上固定的多肽发生反应；(3)通过提取已知组蛋白修饰与待筛选蛋白质结合的复合物，再用LC-MS/MS液质联用的方式鉴定能与已知组蛋白修饰结合的蛋白质种类。
组蛋白修饰芯片上固定有包含溶胶-凝胶材料与组蛋白质修饰多肽混合物的位点，且位点均可固定在任意大小的孔板、尼龙膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、玻璃板或硅板上。溶胶-凝胶材料物质包含13.5～21重量份的TMOS、8～17重量份的MTMS和3～13.5重量份的GPTMOS。
本发明所选的固定在载体上的组蛋白修饰多肽底物通常包含6-14个氨基酸，组蛋白修饰多肽底物包括H1、H2A、H2B、H3、H4组蛋白在相关酶作用下的各个反应位点发生的甲基化、乙酰化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等修饰。
在此检测已知组蛋白修饰与待筛选蛋白质是否结合，可以通过将待筛选蛋白质混合物与组蛋白修饰芯片位点发生反应，然后提取反应后的复合物，再用LC-MS/MS液质联用的方式分析测定碎片离子的大小，将质谱数据与蛋白质数据库进行比对，获得肽段序列，从而确定和特定的组蛋白修饰结合的蛋白质的种类。
本发明中，组蛋白质修饰芯片载体可以是任意大小的孔板、尼龙膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、玻璃板或硅板，其大小主要是依据待筛选的蛋白质种类数量而定。
本发明中，待筛选蛋白质优选地选自内源性蛋白质混合物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明专利的技术方案，下面将对技术的技术路线以附图的形式作简单地介绍。
图1为大规模高通量筛选与已知组蛋白修饰相结合的蛋白质的方法的路线图。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。
实施例1：取组蛋白修饰H3K4、H3K9的多肽，分别置于2*10的孔板中的第一行、第二行，然后在每一孔中与溶胶-凝胶材料组分(15％的TMOS、8％的MTMS和25％的GPTMOS)混合，并经点样仪点样固定在孔板中。
取小鼠肝脏组织样本切割成块，并转移到匀浆器中。在预冷的裂解缓冲液中加PMSF/异丙醇储备液(2mL)。迅速将2mL预冷的裂解缓冲液加入匀浆器中，冰浴条件下充分研磨。将组织研磨液转移到1.5mL的离心管中，于4℃离心(14000rpm,10min)。离心完毕吸取上清液转移至一新的1.5mL离心管中，即为组织蛋白粗提取液。所获蛋白质提取液可保存于-20℃用于后续实验备用。
取上述蛋白质提取液用点样仪点样并分别固定在上述孔板中反应1小时。将板用含有脱脂奶的溶液封闭，防止无亲和性的物质粘到芯片上。将孔板中的物质取出，用玻璃棒碎胶，用缓冲液(0.25％溴酚蓝溶液：0.25％二甲苯青FF：40％蔗糖水溶液＝15:15:70)溶解，缓冲液浸泡过夜，离心后取上清液浓缩，将浓缩液用超声波辅助酶解15s，将酶解液用0.45μm滤膜过滤，滤液利用LC-MS/MS质谱方式分析。
其中液相色谱条件为：
色谱柱：MONO-Q柱；
进样量：10μL；
流动相A为：10mmol/L的NaOH，流动相B为：10mmol/L的NaOH+1.8mol/L的NaCl；
梯度为：0-5min，0％B,5-23min，0-80％B,23-25min，100％B；流速：0.2mL/min；
检测波长：UV230nm检测。
质谱采集系统为5600Q-TOF质谱仪(美国Applied Biosystems公司)，扫描采用数据依赖模式：进行一个全扫描(扫描范围m/z350-1500)，选择最强的50个母离子进行二级扫描(信号阈值为150cps)；电喷雾电压2300V，正离子模式；经400min采集分析。
质谱测定参数设置如下：质荷比范围：400-5000，步长(step size)：0.25，扫描时间：6s，低OR电压：35V，高OR电压：100V。其它参数设置均按照PPG校正仪器后的参数设置。
串联质谱分析以此出现的蛋白质复合物的数据，分析显示有5种不同的蛋白质复合物，其中组蛋白修饰H3K4与小鼠肝脏中2种蛋白质结合，分别为抗胰蛋白酶、铜兰蛋白，组蛋白修饰H3K9与小鼠肝脏中3种蛋白质结合，分别为纤维蛋白原、血浆脂蛋白、Y-珠蛋白。抗胰蛋白酶：
HRMS-EI(70eV)m/z calcd for C13H12N3S[M+H]+242.0752，252.3，354.2，369.3，546.3，552.6，1301.21found 242.0752，252.3，354.2，369.3，546.3，552.6，1301.21
序列为SETAPPAAAPPAEKAPVKKKAGGPPPRKASGPPKASELITKAVASKEPS
铜兰蛋白：
HRMS-EI(70eV)m/z[M+H]+230.1657,223.62，336.521，554.12，625.3，1524.56found230.1654，223.62，336.521，554.12，625.3，1524.56
序列为：SGRGKQGGKARALALTRSSRAGQFVRRLASGTKA
纤维蛋白酶：
HRMS-EI(70eV)m/z[M+H]+280.0449，296.2136，356.223，332.1563，546.3，658.965found280.0454,296.2136，356.223，332.1563，546.3，658.965
序列为：
ARTKQTARKSTGGKAQQKQLATKATGGVKKRPGTVALREIIRYQELLIRKPF
血浆脂蛋白：
HRMS-EI(70eV)m/z[M+H]+270.1218，398.6325，568.324，854.2354，889.6538found270.1219，270.1218，398.6325，568.324，854.2354，889.6538
序列为：SGPGLGGLGGLGGALRJRLVBRLMOTKARRGGVKRI
Y-珠蛋白
HRMS-EI(70eV)m/z[M+H]+370.3318，526.965，598.2561，867.2564，965.5562.found370.3318，526.965，598.2561，867.2564，965.5562.
序列为：AGGGLGQQLGGKQGALRJRATTGQQKARRGGVKRI
实施例2：
取组蛋白修饰H3K27、H3K36的多肽，分别置于2*6的孔板中的第一行、第二行，然后在每一孔中与溶胶-凝胶材料组分(13.5％的TMOS、16％的MTMS和11.5％的GPTMOS)混合，并经点样仪点样固定在孔板中。
400g肝组织置于4ml蛋白质裂解液A中(10mmol/LMgCl2，1mmol/LKCl，1mmol/L苯四基磺酰氟，1mmol/L二硫苏糖醇)，匀浆直至肉眼看不见颗粒，再加入3mmol/L蔗糖数滴混匀，10000r/min4℃离心30min后，弃上清。将沉淀溶于3-5倍的蛋白质裂解液(0.5mol/LKCl)中混匀，10000r/min4℃离心30min后，取上清液-80℃保存，备用。
取上述蛋白质提取液用点样仪点样并分别固定在上述孔板中反应1小时。将板用含有脱脂奶的溶液封闭，防止无亲和性的物质粘到芯片上。将孔板中的物质取出，用玻璃棒碎胶，用缓冲液(0.3％溴酚蓝溶液：0.3％二甲苯青FF：40％蔗糖水溶液＝25:15:60)溶解，缓冲液浸泡过夜，离心后取上清液浓缩，将浓缩液用超声波辅助酶解15s，将酶解液用0.45μm滤膜过滤，滤液利用LC-MS/MS质谱方式分析。
其中液相色谱条件为：
色谱柱：MONO-Q柱；
进样量：10μL；
流动相A为：10mmol/L的NaOH，流动相B为：10mmol/L的NaOH+1.8mol/L的NaCl；
梯度为：0-8min，0％B,5-25min，0-80％B,25-35min，100％B，35-40min；流速：0.2mL/min；
检测波长：UV230nm检测。
质谱采集系统为5600Q-TOF质谱仪(美国Applied Biosystems公司)，扫描采用数据依赖模式：进行一个全扫描(扫描范围m/z350-1500)，选择最强的50个母离子进行二级扫描(信号阈值为150cps)；电喷雾电压2300V，正离子模式；经400min采集分析。
质谱测定参数设置如下：质荷比范围：400-5000，步长(step size)：0.25，扫描时间：6s，低OR电压：35V，高OR电压：100V。其它参数设置均按照PPG校正仪器后的参数设置。
串联质谱分析以此出现的蛋白质复合物的数据，分析显示有4种不同的蛋白质复合物，其中组蛋白修饰H3K27与大鼠肾脏中2种蛋白质结合，分别为抗胰蛋白酶、纤维蛋白，组蛋白修饰H3K36与小鼠肝脏中2种蛋白质结合，分别为骨形成蛋白、酪蛋白。
抗胰蛋白酶：
HRMS-EI(70eV)m/z calcd for C13H12N3S[M+H]+242.0752，252.3，354.2，369.3，546.3，552.6，1301.21found 242.0752，252.3，354.2，369.3，546.3，552.6，1301.21
序列为SETAPPAAAPPAEKAPVKKKAGGPPPRKASGPPKASELITKAVASKEPS
纤维蛋白：
HRMS-EI(70eV)m/z[M+H]+280.0449，296.2136，356.223，332.1563，546.3，658.965，1301.321。found 280.0454,296.2136，356.223，332.1563，546.3，658.965，1301.321
序列为：
ARTKQTARKSTGGKAQQKQLATKATGGVKKRPGTVALREIIRYQELLIRKPF
骨形成蛋白：
HRMS-EI(70eV)m/z[M+H]+392.1218，498.6325，638.324，854.2354，989.6538
found 392.1218，498.6325，638.324，854.2354，989.6538
序列为：SGPAKGLSDLGGLGGAVKRLVBRLMOTKARRGGVKRI
酪蛋白：
HRMS-EI(70eV)m/z[M+H]+372.1218，459.6325，638.324，921.2354，978.6538
found 372.1218，459.6325，638.324，921.2354，978.6538
序列为：AGPGGLSDLAKLGGAVARLVBRLVKATKARI
综上所述，本发明突破了目前单一或少量的鉴定方式，操作方法清晰，一次鉴定数量多，通量高，规模大，鉴定结果准确。
虽然已经针对具体特征对本发明作了详细描述，然而本领域技术人员明显可知，该描述仅是优选的实施方式，并不限制本发明的范围，因此，本发明的实质范围将通过所附权利要求及其等同体来限定。