一种高通量诱变筛选、长周期连续培养与实时观察装置的制作方法

本实用新型涉及动物、植物及微生物诱变筛选、长周期连续培养与实时观察技术领域。

背景技术：

动物、植物及微生物细胞具有独特和高效的生物转化能力，能产生多种代谢产物，其产物中的一些生物活性物质(如多肽、抗生素、氨基酸等)在医药和化工行业中有着不可取代的地位。通常从自然界得到的野生菌株代谢产物产量往往较低，不能满足工业生产的需要，因此如何对菌种进行改良，以获得高效高产的优良工业菌株的难题凸显。而诱变筛选的目的就是要人为地使某些代谢产物过量积累，把生物合成的代谢途径朝着人们所希望的方向加以引导，获得所需要的高产、优质和低耗的菌种，以降低生产成本。微生物诱变处理一般采取物理诱变方法如紫外线和化学诱变方法如碱基类似物等传统方法。但是，这些方法具有耗时、费力、工作量大等缺点。

本实用新型的一重要应用是用于生物细胞的多条件多批次多菌株诱变筛选与长周期连续培养及实时观察。该发明并具有实时掌握细胞生长与诱变情况，是一种有效的多条件、多批次与多菌株同时诱变筛选的方法与设备。采用本实用新型进行生物细胞的人工诱变筛选能有效解决传统诱变筛选耗时、耗力与成本较高等问题。

技术实现要素：

本实用新型解决的技术问题在于，提供一种高通量诱变筛选、长周期连续培养与实时观察装置，用于对生物细胞进行多菌株、多批次与多条件诱变筛选，并对细胞进行培养与观察。本实用新型在进行菌种诱变筛选时可实现多菌株、多批次及多条件诱变筛选，同时具有长周期连续培养的能力。在进行诱变筛选和培养时可实现实时原位观察。

为了实现上述目的本实用新型提供了一种高通量诱变筛选、长周期连续培养与实时观察装置，包括：

一反应器本体，为一箱体，所述箱体的四周及底部均设有黑色不透光材质；

一诱变光源装置，设置于所述反应器本体内的底部；

一用以培养生物细胞的菌种培养装置，设置于所述反应器本体内且位于所述诱变光源装置的中上部；

一补料装置，通过一补给管与所述菌种培养装置连接；

一用以实时记录生物细胞诱变及生长情况的摄像装置，固定于反应器本体的顶部且位于菌种培养装置上方；

一用以接收并处理摄像装置输出的图像数据的图像处理系统，与所述摄像装置电性连接。

所述的高通量诱变筛选、长周期连续培养与实时观测装置，其特征在于，所述诱变光源装置进一步包括紫外灯和灯架,所述灯架固定于反应器底部，紫外灯固定于灯架上。

所述的高通量诱变筛选、长周期连续培养与实时观测装置，其特征在于，所述菌种培养装置进一步包括培养多孔板、多个玻璃盖板、支架和系列遮光板，所述支架设置于反应器本体内且固定于所述反应器本体的内壁上，所述培养多孔板放置于所述支架上，所述培养多孔板包括多个培养孔及与其相连的加液孔，所述玻璃盖板对应盖设于培养多孔板的每个培养孔上，所述加液孔露出所述玻璃盖板之外，根据需要选择某一系列遮光板盖设在盖有玻璃盖板的培养多孔板上。

所述的高通量诱变筛选、长周期连续培养与实时观测装置，其特征在于，所述补料装置进一步包括塑料胶管、蠕动泵和储液罐，所述塑料胶管插入所述储液罐内，所述蠕动泵设置于塑料胶管上，所述补给管一端与所述塑料胶管连接，另一端连接到所述加液孔上。

所述的高通量诱变筛选、长周期连续培养与实时观测装置，其特征在于，所述培养多孔板为设有16个培养孔的培养板，每个培养孔底部到培养板上表面的距离50mm，每个培养孔直径为35mm，与所述培养孔连通的加液孔的直径为3mm，加液孔的底部到培养板上表面20mm。

所述的高通量诱变筛选、长周期连续培养与实时观测装置，其特征在于，所述加液孔中装有小型细菌过滤器。

所述的高通量诱变筛选、长周期连续培养与实时观测装置，其特征在于，所述细菌过滤器为有机高分子过滤膜。

所述的高通量诱变筛选、长周期连续培养与实时观测装置，其特征在于，所述系列遮光板进一步包括：系列孔板和遮光板；所述系列孔板是指孔板上有序排列着数目不等的小孔，遮光板为具有完全遮光效果的实体板。

所述的高通量诱变筛选、长周期连续培养与实时观测装置，其特征在于，所述系列孔板包括指数孔板和倍数孔板；指数孔板是指孔板上的小孔数呈指数增长；倍数孔板是指孔板上的小孔数呈倍数增长。

所述的高通量诱变筛选、长周期连续培养与实时观测装置，其特征在于，所述培养多孔板、玻璃盖板均为透明有机玻璃板，所述玻璃盖板厚度1mm。

本实用新型的有益效果为：

利用上述装置，可实现多菌株、多批次与多条件诱变筛选，同时具有长周期连续培养的能力。

本实用新型还可以在进行诱变筛选和培养时可实现实时原位观察，及时对诱变条件进行调整，通过观察设备对细胞进行多方位实时动态观察，并通过图像处理技术对数据进行分析。

附图说明

图1高通量筛选、连续长周期培养与实时观察装置示意图。

图2诱变光源装置示意图。

图3菌种培养装置示意图。

图4培养多孔板装置示意图。

图5玻璃盖板示意图。

图6系列遮光板结构示意图。

图7遮光板的结构示意图。

图8补料装置示意图。

图9菌种培养装置纵向界面图。

图10有机高分子过滤膜。

图11热带假丝酵母的生长曲线。

图12热带假丝酵母S9的产酶曲线。

附图标记为：

反应器本体 1

诱变光源装置 11

紫外灯 111

菌种培养装置 12

培养多孔板 121

培养孔 1211

加液孔 1212

细菌过滤器 12121

玻璃盖板 122

系列遮光板 123

系列孔板 1231

指数孔板 12311

倍数孔板 12312

支架 124

遮光板 125

补料装置 13

储液罐 131

塑料胶管 132

蠕动泵 133

补给管 134

摄像装置 14

摄像机 141

固定架 142

不透光材质 15

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本实用新型的高通量诱变筛选、长周期连续培养与实时原位观察装置的结构特点及应用，进行详细的描述。以下对具体实施例的描述仅为说明本实用新型的实现细节，并非用于限定本实用新型的具体保护范围。本实用新型的保护范围需以后附的权利要求书所限定的内容为准。

本实用新型为满足不同生物细胞多诱变条件的高通量筛选，并通过长周期连续培养实现实时原位观察的需求，设计了如图1所示的一种高通量诱变筛选、长周期连续培养与实时观测装置，包括：反应器本体1、诱变光源装置11、菌种培养装置12、补料装置13、用以记录生物细胞诱变及生长情况的摄像装置14、用以接收并处理摄像装置14输出的图像数据的图像处理系统。

反应器本体11，为一箱体，在反应器本体1内的底部设置诱变光源装置11，诱变光源装置11进一步包括紫外灯111和灯架,灯架固定于反应器底部，紫外灯111固定于灯架上。为防止紫外灯111发散的光束对人体的危害，在箱体的四周及底部均设有不透光材质，黑色不透光有机玻璃15厚度为30mm。。

在箱体内的中上部位置设有用以培养生物细胞的菌种培养装置12，菌种培养装置12进一步包括培养多孔板121、多个玻璃盖板122、支架124和系列遮光板123，支架124固定于反应器本体1的内壁上，培养多孔板121设置于支架124上，培养多孔板121包括多个培养孔1211及与其相连的加液孔1212，玻璃盖板122对应盖设于培养多孔板121的每个培养孔1211上，加液孔1212露出玻璃盖板122之外，根据需要选择系列遮光板123盖设在盖设有玻璃盖板122的培养多孔板121上。培养多孔板121例如为16孔培养板，每个培养孔1211底部到培养板上表面距离50mm，培养孔1211直径为35mm，与培养孔1211连通的加液孔1212的直径为为3mm，加液孔1212的底部到培养板上表面20mm。加液孔1212中装有小型细菌过滤器12121，细菌过滤器12121是一种有机高分子过滤膜(如图10)。

系列遮光板123进一步包括：系列孔板1231和遮光板125；系列孔板1231是指孔板上有序排列着数目不等的小孔，致使每个培养孔1211处具有不同的遮光效果，遮光板125为具有完全遮光效果的实体板。系列孔板1231进一步包括指数孔板12311和倍数孔板12312；指数孔板12311是指孔板上的小孔数呈指数增长(如3，32，33，34，……)；倍数孔板12312是指孔板上的小孔数呈倍数增长(如3，6，12，24，……)，详细之，指数孔板12311或倍数孔板12312是有多个单独的设有不同孔数的板逐次排列形成，本实用新型中的指数孔板12311或倍数孔板12312包括不设孔的板，也就是包括完全遮光效果的实体板。而遮光板125，是有许多完全遮光效果的实体板逐次排列形成。

为了能够为多种生物细胞提供长周期连续培养，还设置一补料装置13，该补料装置13设置于反应器箱体外，通过一补给管134与菌种培养装置12连接，补料装置13进一步包括塑料胶管132、蠕动泵133和储液罐131，塑料胶管132插入储液罐131内，蠕动泵133设置于塑料胶管132上，补给管134一端与塑料胶管132连接，另一端连接到加液孔1212上。图9所示为本实用新型的连菌种培养装置12的纵向截面图。由于培养孔1211与加液孔1212相连，故而可以通过加液孔1212向培养孔1211进行连续加液，从而保证生物细胞的连续长周期培养。加液孔1212的底部高度处于培养孔1211的中上部，保证了培养液不会倒流入加液孔1212中。如图8所示，加液孔1212通过塑料胶管132与蠕动泵133和储液罐131相连，保证新鲜液体培养基可以连续添加到培养孔1211中。

为了能够实时原位拍摄细胞诱变及生长情况，在菌种培养装置12上部设置摄像装置14，摄像装置14，包括一摄像机、一固定架142，固定架142固定于反应器本体的顶部盖板上，摄像机141通过该固定架142设置在箱体的顶部的盖板上，固定架142最好为十字架结构，能使摄像机141沿X轴和Y轴水平移动。摄像装置与一图像处理系统电性连接，摄像装置拍摄的图像输出给图像处理系统，图像处理系统接收并处理分析摄像装置输出的图像数据。

该培养多孔板121进一步包括：16孔培养板，每个培养孔底部到培养板上表面距离50mm，培养孔直径为35mm，并连有一个直径为3mm的小孔，小孔底部到培养板上表面20mm，小孔中装有小型细菌过滤器12121，细菌过滤器12121是一种有机高分子过滤膜(如图10)，每个培养孔可装有1-5mL培养液，用于生物细胞的诱变筛选与培养。

本实用新型可以在同一培养多孔板121上培养多种生物细胞，可进行多批次、多条件诱变筛选与长周期连续培养。各培养孔有独立的培养空间，可使用相同或者不同的培养基。

为了达到较佳的诱变筛选的目的，培养板底面的厚度应尽量小，优选的实施例为1-4mm；为了能清晰的观察细胞培养情况，培养多孔板121玻璃盖板122厚度应尽量小，优选的实施例为0.5-2.5mm。培养孔深度优选的实施例范围20-80mm。加液孔1212深度优选的实施例范围10-30mm。为了满足不同诱变条件，系列遮光板123的孔分布优选的实施例为指数孔板12311(3，3²，3³，3⁴，……)和倍数孔板12312(3，6，12，24，……)。

下面的实施例将对本实用新型做进一步的说明，但并不因此而限制本实用新型。

实施例1

本实施例为采用本实用新型进行生物细胞连续长周期培养，考察细胞情况。该反应器本体1为有机玻璃制造的箱体，主要结构参数如下：反应器本体1的横截面长边为1370mm，短边为940mm，纵截面高度为600mm；培养装置上放置12个培养多孔板121，每个培养孔底部到培养板上表面距离50mm，培养孔直径为35mm，并连有一个直径为3mm的加液孔，加液孔底部到培养板上表面20mm,在蠕动泵133的驱使下，通过加液孔将新鲜的培养液加入到培养孔中，保证细胞的正常生长需要。液体培养基(g/L)配方：葡萄糖30；酵母粉6；NH₄Cl6；MgSO₄·7H₂O 0.4；KH₂PO₄ 1；K₂HPO₄ 1；pH 6.5。以5％的接种量接入装有3ml液体培养基培养孔中，30℃，培养40h。热带假丝酵母的生长曲线分为延滞期、对数期、稳定期、衰亡期四个时期。接种后，经过一段延滞期后(约4h)，菌体迅速增殖进入对数期，在22h左右进入稳定期，菌体OD₅₈₀值较为稳定(如图11)。

实施例2

本实施例为采用本实用新型进行高通量诱变筛选试验，在不同紫外线照射时间和不同透光量的条件下，同时考察五种菌株的诱变情况，最终得到高酶活力的酵母细胞。系列遮光板安装在培养多孔板121底部，系列遮光板透光孔数呈指数分布(0，3，9，27，……)和倍数增长(如3，6，12，24，……)；使用25W、254nm的紫外灯管，照射距离为40cm，照射时间分别为0、10、20、30、40、50和60s，照射完毕后避光培养24h。液体培养基配方如实例1所示，同时又加入45mmol/L苯乙酮。30℃下，每分钟还原苯乙酮生成1μg苯乙醇所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。收集反应液通过气相色谱分析产物苯乙醇的生成量，并计算酶活力(U)。

实验结果显示，系列遮光板孔数为9，照射时间为40s，诱变得到的酵母细胞S9酶活较高(如表1)，值为485U/L。

表1不同菌株诱变前后酶活情况

实施例3

本实施例为采用本实用新型对诱变菌株(热带假丝酵母S9)连续长周期培养，考察其产酶活性。在如实施例1液体培养基中加入45mmol/L苯乙酮，在30℃下发酵40h，气相色谱分析方法测定苯乙醇的含量，从而计算酶活。由图12可知，在细胞的培养过程中，从2h开始细胞酶活力持续上升，到22h时酶活力(Enzyme activity)达到最高(512U/L)，维持约4h的较高酶活力，随后酶活力开始下降，因此细胞的最佳培养时间为22h。