本发明涉及体外诊断领域，尤其涉及一种脂蛋白相关磷脂酶Lp-PLA2活性及总量检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：据世界卫生组织统计，中国每年死于心脑血管疾病的人达300万以上，每10秒就有1人死于心血管病，我国心脑血管疾病发病和致死亡人数已位列第一，远远超过了癌症等其他疾病。随着我国人口的不断老龄化，患心脑血管疾病的人群逐年增加，并趋于低龄化；我国现患病人数已达6000万以上，每年发生卒中病人达200万，发病率高达120/10万，每年卒中病人死亡120万，是常发于老年男性55岁以上、女性65岁以上或绝经后妇女中的一种常见疾病。老年人、抽烟喝酒、高血压、糖尿病、肥胖、血脂异常、缺乏体力活动及精神压力大等人群为冠心病等系列心血管疾病的易感人群。血浆脂蛋白相关磷脂酶A2(lipoprotein-associatedphospholipaseA2，Lp-PLA2)是磷脂酶A2(PhospholipaseA2，PLA2)超家族中的一员，由441个氨基酸残基组成，相对分子量为45.4kD，以酶活性形式循环在血液中。LP-PLA2是丝氨酸依赖的磷脂酶,其催化活性不需要钙离子。LP-PLA2酶活性区域位于蛋白C端，S273，D296，H351氨基酸残基组成酶催化活性核心位点；189-239氨基酸残基形成片成结构，参与控制酶底物的特异性，并为低密度脂蛋白(LDL)结合区域；367-370氨基酸残基参与高密度脂蛋白(HDL)结合。Lp-PLA2主要由成熟的巨噬细胞和淋巴细胞合成和分泌，并受炎性介质的调节，人循环中的Lp-PLA2以与脂蛋白颗粒结合的形式存在。Lp-PLA2是新近发现的一种具有强烈促炎症作用的生物学标记物，是一种新型的特异性的血管炎症标志物，其浓度或活性升高是心血管事件的独立危险因子，与心肌梗塞的发病风险和缺血性中风(脑动脉血栓)的发病风险正相关，可以作为冠心病和缺血性脑卒中动脉粥样硬化等心脑血管疾病的临床超前预测指标。新近美国FDA批准其用于预测冠心病和缺血性卒中风险。因此开发出一种新的用于心脑血管疾病超前预测的检测试剂盒，能够提前预测患者病情，及时治疗，降低患病风险和患者死亡风险，减轻社会负担、减轻病人的痛苦，简化了治疗的流程，降低医生的工作强度，同时也能大大降低国家、医院以及患者个人的治疗费用支出，减轻社会负担，具有重要的、积极的社会意义。在现有技术中，用酶联免疫法测定血液中LP-PLA2的含量，间接表明血液中LP-PLA2酶活性，而动脉硬化活动状况与血液中LP-PLA2酶活性相关，有时LP-PLA2含量与LP-PLA2活性并不相关，如LP-PLA2基因变异人群及血液中有LP-PLA2抑制物的人群；直接测定血液LP-PLA2酶活性方法是直接加LP-PLA2酶底物到血清/血浆中，其中LP-PLA2分解合成反应底物，生成颜色反应产物，再测算出LP-PLA2酶活性。这种方案的缺点是血液一些成分直接影响检测LP-PLA2酶活性的结果，如血红素，胆红素，代谢产物，药物等；血液或细胞液中还有LP-PLA2类似PLA2磷脂酶存在，也能水解LP-PLA2酶底物，降低检测血液LP-PLA2酶活性的特异性。技术实现要素：基于此，有必要提供一种新的脂蛋白相关磷脂酶Lp-PLA2检测方式，来去除样品种其他杂质的干扰，提高Lp-PLA2测定的准确性。根据本发明的第一方面，本发明提供一种脂蛋白相关磷脂酶Lp-PLA2活性及总量检测试剂盒，包括有固相载体、酶分解底物、缓冲液、酶标抗体试剂、洗涤液、显色底物、终止液、酶活性校准品和/或酶免校准品，其中：所述固相载体包被有抗-Lp-PLA2特异N端非抑制性抗体；所述酶分解底物为血小板活化因子、血小板活化因子类似物或其氧化修饰的磷脂酰胆碱；所述酶标抗体试剂为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶或生物素标记的抗-Lp-PLA2抑制性抗体；所述酶活性校准品包括含有多种浓度的对硝基酚标准品；所述酶免校准品包括含有Lp-PLA2抗原的多个参考校准品；所述显色底物包含0.015-0.02％的过氧化物的显色底物A液和包含0.25-0.32g/L的TMB的显色底物B液。根据本发明的第二方面，本发明提供一种一种脂蛋白相关磷脂酶Lp-PLA2检测方法，用于采用如上所述的试剂盒对人血清或血浆中的脂蛋白相关磷脂酶进行活性及总量检测，包括：在酶标板的每孔中加入100ul抗Lp-PLA2N端抗体(5ug/ml)和50mM碳酸盐缓冲液，调节pH值为9.6，在4℃条件下静止8-12小时后，去除缓冲液；在酶标板的每孔中加入200μl封闭液，在4℃条件下封闭2小时后，去除封闭液；在酶标板的每孔中加入80ul样品稀释液和20ul血清或血浆样品，在室温下反应30分钟后，去除稀释液；加入200ul缓冲液和50ul酶分解底物，混合反应2分钟后，测定OD值；绘制酶活性-OD值标准曲线，算得待测样品中LP-PLA2酶活性；加入酶标抗体试剂100μl，置37℃继续温育30分钟；在酶标板的每孔中加入显色底物A液和显色底物B液各50μl混匀，37℃避光显色15分钟后，每孔加终止液50μl，混匀后10分钟内，测定校准品和待检样品的OD值；以校准品抗原浓度为横坐标、校准品相应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，并将待测样品OD值代入标准曲线中，算得待测样品中LP-PLA2浓度。本发明的有益效果是：本发明的实施例通过选用LP-PLA2N端非抑制性抗体，能特异性LP-PLA2N端，不干扰LP-PLA2C端酶催化结构区域酶活性，进行抗体扑获LP-PLA2酶活性测定试验，扑获出血液中LP-PLA2，去除了样本中其他物质的干扰，并可为酶活抑制剂的研发提供依据，酶总量及酶活性结果同时检测可更准确的反应Lp-PLA2在体内的情况，使临床做出更准确地判断。既改良了传统的酶检测法，又可继续完成酶联免疫检测，一个样本，一次检测，同时获得酶活性及总量的检测。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本发明的人脂蛋白相关磷脂酶Lp-PLA2活性及总量检测方法一个实施例中Lp-PLA2的含量曲线示意图。具体实施方式下面详细描述本发明提供的人脂蛋白相关磷脂酶Lp-PLA2活性及总量检测试剂盒的一个实施例；本实施例主要包括有固相载体、酶分解底物、缓冲液、酶标抗体试剂、洗涤液、显色底物、终止液、酶活性校准品和/或酶免校准品，其中：所述固相载体包被有抗-Lp-PLA2特异N端非抑制性抗体；所述酶分解底物为血小板活化因子、血小板活化因子类似物或其氧化修饰的磷脂酰胆碱；所述酶标抗体试剂为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶或生物素标记的抗-Lp-PLA2抑制性抗体；所述酶活性校准品包括含有多种浓度的对硝基酚标准品；所述酶免校准品包括含有Lp-PLA2抗原的多个参考校准品；所述显色底物包含0.015-0.02％的过氧化物的显色底物A液和包含0.25-0.32g/L的TMB的显色底物B液。在一个具体的实施方式中，所述固相载体可采用含有以下组分的包被液包被所述抗-Lp-PLA2特异N端抗体：Na2CO3：1.59g/L；NaHCO3：2.93g/L；在一个具体的实施方式中，所述固相载体可采用含有以下组分的封闭液封闭所述抗-Lp-PLA2特异N端抗体：BSA：10.0g/L；蔗糖：52.0g/L；酪蛋白：5.0g/L；NBS：100ml/L；明胶：5.0ml/L；50mMTB8.0：50ml/L；Proclin300：1.0ml/L。在一个具体的实施方式中，所述固相载体可采用含有以下组分的缓冲液缓冲所述抗-Lp-PLA2特异N端抗体：Hepes：4.8g/LNaCl：8.8g/LEDTA：1.5g/L；在一个具体的实施方式中，所述酶分解底物溶液可包括以下组分：血小板活化因子(PAF)、PAF类似物及其氧化修饰的磷脂酰胆碱：1～3mmol/L；Citricacidmonohydrate：4.2g/L；Ethanol：100ml/L。在一个具体的实施方式中，所述酶标抗体试剂采用含有以下组分的稀释液：BSA：10.0g/L；蔗糖：52.0g/L；酪蛋白：5.0g/L；NBS：100ml/L；明胶：5.0ml/L；50mMTB8.0：50ml/L；Proclin300：1.0ml/L。在一个具体的实施方式中，所述校准品包括有Lp-PLA2抗原含量分别为1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、100ng/ml、50ng/ml和0ng/ml的至少一种校准品；且所述校准品采用含有以下组分的校准品稀释液：Na2HPO4·12H2O：53.7g/L；NaH2PO4·2H2O：7.8g/L；NBS：200ml/L；甘油：50ml/L；Tween-20：1ml/L；Proclin300：1ml/L。在一个具体的实施方式中，所述显色底物A液包括以下组分：三水合乙酸钠：27.2g/L；柠檬酸：3.2g/L；30％H2O2：0.6ml/L；和/或者，所述显色底物B液包括以下组分：乙二胺四乙酸二钠0.4g/L；柠檬酸；1.9g/L；甘油；100ml/L；TMB；0.3g/L；DMSO：6ml。在一个具体的实施方式中，所述浓缩洗涤液包括以下组分：Na2HPO4·12H2O：71.6g/L；KH2PO4：4.8g/L；NaCl：160g/L；KCl：4g/L；Tween-20：20ml/L。在一个具体的实施方式中，所述浓缩洗涤液(20X)：0.01MPBS，含有不低于1.5％的表面活性剂；所述缓冲液含有小于50mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)；所述终止液含有浓度不高于2mol/L的硫酸。在本发明的一个实施例中，所述固相载体可以是酶标板或者平底试管，也可以是其他可用于包被的固相载体等。所述血小板活化因子(PAF)、PAF类似物或其氧化修饰的磷脂酰胆碱可以是：1-肉豆蔻酰-2-(4-硝基苯基琥珀酰基)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱；1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰乙醇胺；1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰甘油；1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰胆脂；1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷酸等。本发明的实施例采用以所述血小板活化因子(PAF)、PAF类似物或其氧化修饰的磷脂酰胆碱为底物的检测方法及双抗体夹心酶联免疫法来测定样品中Lp-PLA2活性及总量。加入样品后，在酶标板上预包被的抗Lp-PLA2N端特异抗体可与样品中的Lp-PLA2结合，加入1-肉豆蔻酰-2-(4-硝基苯基琥珀酰基)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱，Lp-PLA2水解底物1-肉豆蔻酰-2-(4-硝基苯基琥珀酰基)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱的sn位点，生成4-硝基苯基琥珀酰基，其在水溶液中降解后生成的对硝基酚可通过光学系统进行监测，通过特定波长下吸光度的变化即可监测出Lp-PLA2的活性。进一步加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗Lp-PLA2抗体进行温育。当样品中存在Lp-PLA2时，将形成“包被抗体-抗原-酶标抗体”复合物。复合物上连接的HRP催化显色剂反应，生成蓝色产物，终止反应后变为黄色。若样品中无Lp-PLA2时，不显色。显色深浅与样本中Lp-PLA2的含量呈正比。通过酶标仪检测吸光度(OD值)，以校准品浓度值为横坐标、校准品OD值为纵坐标做标准曲线，计算样品中Lp-PLA2含量。下面参考图1详细描述本发明提供的脂蛋白相关磷脂酶Lp-PLA2检测方法的一个实施例；本实施例用于采用前述实施例中描述的试剂盒对人血清或血浆中的脂蛋白相关磷脂酶进行检测，含有EDTA、柠檬酸钠或肝素等抗凝剂的样品可用本试剂检测。本实施例主要包括：在酶标板的每孔中加入100ul抗Lp-PLA2N端抗体(5ug/ml)和50mM碳酸盐缓冲液，调节pH值为9.6，在4℃条件下静止8-12小时后，去除缓冲液；在酶标板的每孔中加入200μl封闭液，在4℃条件下封闭2小时后，去除封闭液；在酶标板的每孔中加入80ul样品稀释液和20ul血清或血浆样品，在室温下反应30分钟后，去除稀释液；加入200ul缓冲液(200mMHepespH7.6，150mMNaCl，5mMEDTA)和50ul酶分解底物(1～3mmol/L酶底物1-肉豆蔻酰-2-(4-硝基苯基琥珀酰基)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱，10％Ethanol，20mMCitricacidmonohydratepH4.5)，混合反应2分钟后，测定OD值，具体实现时，可选用波长405nm段测定OD值；用0、50、100、200、400和800UILp-PLA2绘制酶活性-OD值标准曲线，算得待测样品中LP-PLA2酶活性。另外，本实施例中，在计算出血液样品中LP-PLA2酶活性后还包括：加入酶标抗体试剂100μl，置37℃继续温育30分钟；在酶标板的每孔中加入显色底物A液和显色底物B液各50μl混匀，37℃避光显色15分钟后，每孔加终止液50μl，混匀后10分钟内，测定校准品和待检样品的OD值；(此时蓝色立转黄色)。空白孔调零，450nm波长测量各孔吸光度(OD值)。以校准品抗原浓度为横坐标、校准品相应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，并将待测样品OD值代入标准曲线中，算得待测样品中LP-PLA2浓度。在一个具体的实施方式中，所述计算出血液样品中LP-PLA2酶活性包括：用纯对硝基酚为标准品，分别制备出0、10、20、40、80和120nmol/ml的对硝基酚标准品，测定出不同浓度对硝基酚标准品的OD值，绘制出对硝基酚标准品浓度与OD值关系标准曲线，计算出曲线斜率(K)：K＝(对硝基酚80nmol-40nmol/ml)/(80nmol/mlOD值-40nmol/mlOD值)；50、100、200和400ng/ml浓度LP-PLA2与酶底物反应，产生对硝基酚，呈颜色反应，测定不同反应时间(2，3，4，5，6，7，8min)OD值，根据以下公式算出LP-PLA2酶活性单位：LP-PLA2酶活性单位(IU，nmol/ml/min)＝K(OD3min-OD2min)/0.02ml。如下所示：如果一样品的OD值＝0.9780，代入标准曲线，算得Lp-PLA2浓度≈244.61ng/ml。(此校准品OD值和标准曲线仅为示例说明，不具有实际定量作用；每次实验以校准品实际OD值为准)。在一个具体的实施方式中，溫育前加入洗涤剂洗涤一次，溫育完成后加入洗涤剂洗涤3次。下列各表详细示出了本发明的实施例中所使用的各种溶液的具体组分、含量和制备步骤。表1、包被液配方原材料名称配制1000ml用量Na2CO31.59gNaHCO32.93g制备时，先加入900ml纯化水，待表1中全部物质溶解后，调整pH值为9.6±0.1，再定容至1000ml。表2、封闭液配方制备时，先加入800ml纯化水，待表2中全部物质溶解后，再定容至1000ml。表3、缓冲液配方原材料名称配制1000ml用量Hepes4.8gNaCl8.8gEDTA1.5g制备时，先加入800ml纯化水，待表3中全部物质溶解后，调pH至7.6，再定容至1000ml。(200mMHepespH7.6，150mMNaCl，5mMEDTA)表4、酶分解底物溶液配方原材料名称配制1000ml用量Citricacidmonohydrate4.2gEthanol100ml制备时，先加入800ml纯化水，待表4中全部物质溶解后，调pH至2.7，再定容至1000ml。在酶分解底物溶液中加入酶底物1-肉豆蔻酰-2-(4-硝基苯基琥珀酰基)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱，使其浓度为1～3mmol/L。表5、酶标抗体稀释液配方制备时，先加入800ml纯化水，待表5中全部物质溶解后，再定容至1000ml。酶标抗体稀释液配制好后，加入HRP标记抗体，充分混匀，即得到酶标抗体试剂。表6、校准品稀释液配方原材料名称配制1000ml用量Na2HPO4·12H2O53.7gNaH2PO4·2H2O7.8gNBS200ml甘油50mlTween-201mlProclin3001ml制备时，先加入600ml纯化水，待表6中全部物质溶解后，再定容至1000ml。表7、20X浓缩洗涤液配方原材料名称配制1000ml用量Na2HPO4·12H2O71.6gKH2PO44.8gNaCl160gKCl4gTween-2020ml制备时，先加入700ml纯化水，待表7中全部物质溶解后，再定容至1000ml。表8、TMB显色底物A液、B液配方显色底物A液配制：先加入800ml纯化水，待显色底物A液的全部组分溶解后，再定容至1000ml。显色底物B液配制：(1)先将称量好的TMB溶于DMSO中，完全溶解、混匀，待定容前加入；(2)先加入800ml纯化水，待显色底物B液的全部组分溶解后，再加入步骤(1)中的TMB-DMSO溶液和甘油，定容至1000ml。表9、终止液配方原材料名称配制1000ml用量浓硫酸108ml取800ml纯化水置于烧杯中，缓慢加入浓硫酸，最后定容为1000ml。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。当前第1页1 2 3