1.一种脂蛋白相关磷脂酶Lp-PLA2活性及总量检测试剂盒,其特征在于,包括有固相载体、缓冲液、酶分解底物、酶标抗体试剂、洗涤液、显色底物、终止液、酶活性校准品和酶免校准品,其中:
所述固相载体包被有抗-Lp-PLA2特异N端非抑制性抗体;
所述酶分解底物为血小板活化因子、血小板活化因子类似物或其氧化修饰的磷脂酰胆碱;
所述酶标抗体试剂为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶或生物素标记的抗-Lp-PLA2抑制性抗体;
所述酶活性校准品包括含有多种浓度的对硝基酚标准品;
所述酶免校准品包括含有Lp-PLA2抗原的多个参考校准品;
所述显色底物包含0.015-0.02%的过氧化物的显色底物A液和包含0.25-0.32g/L的TMB的显色底物B液。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述固相载体采用含有以下组分的包被液包被所述抗-Lp-PLA2特异N端非抑制性抗体:
Na2CO3:1.59g/L;
NaHCO3:2.93g/L;
和/或者,所述固相载体采用含有以下组分的封闭液封闭所述抗-Lp-PLA2特异N端非抑制性抗体:
BSA:10.0g/L;
蔗糖:52.0g/L;
酪蛋白:5.0g/L;
NBS:100ml/L;
明胶:5.0ml/L;
50mM TB 8.0:50ml/L;
Proclin300:1.0ml/L。
3.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述固相载体采用含有以下组分的缓冲液缓冲所述抗-Lp-PLA2特异N端非抑制性抗体:
Hepes:4.8g/L
NaCl:8.8g/L
EDTA:1.5g/L;
所述酶分解底物溶液包括有以下组分:
血小板活化因子、血小板活化因子类似物或其氧化修饰的磷脂酰胆碱:1~3mmol/L;
Citric acid monohydrate:4.2g/L;
Ethanol:100ml/L。
4.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述酶标抗体试剂采用含有以下组分的稀释液:
BSA:10.0g/L;
蔗糖:52.0g/L;
酪蛋白:5.0g/L;
NBS:100ml/L;
明胶:5.0ml/L;
50mM TB 8.0:50ml/L;
Proclin300:1.0ml/L。
5.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述校准品包括有Lp-PLA2抗原含量分别为1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、100ng/ml、50ng/ml和0ng/ml的至少一种校准品;且所述校准品采用含有以下组分的校准品稀释液:
Na2HPO4·12H2O:53.7g/L;
NaH2PO4·2H2O:7.8g/L;
NBS:200ml/L;
甘油:50ml/L;
Tween-20:1ml/L;
Proclin300:1ml/L。
6.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述显色底物A液包括以下组分:
三水合乙酸钠:27.2g/L;
柠檬酸:3.2g/L;
30%H2O2:0.6ml/L;
和/或者,所述显色底物B液包括以下组分:
乙二胺四乙酸二钠0.4g/L;
柠檬酸;1.9g/L;
甘油;100ml/L;
TMB;0.3g/L;
DMSO:6ml。
7.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述浓缩洗涤液包括以下组分:
Na2HPO4·12H2O:71.6g/L;
KH2PO4:4.8g/L;
NaCl:160g/L;
KCl:4g/L;
Tween-20:20ml/L。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法,其特征在于:
所述固相载体为酶标板或平底试管;
所述血小板活化因子、血小板活化因子类似物或其氧化修饰的磷脂酰胆碱为1-肉豆蔻酰-2-(4-硝基苯基琥珀酰基)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱;1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰乙醇胺;1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰甘油;1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰胆脂;或者1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷酸。
9.一种脂蛋白相关磷脂酶Lp-PLA2检测方法,用于采用权利要求1-8中任一项所述的试剂盒对人血清或血浆中的脂蛋白相关磷脂酶的活性及总量进行检测,其特征在于,包括:
在酶标板的每孔中加入100ul抗Lp-PLA2N端非抑制性抗体(5ug/ml)和50mM碳酸盐缓冲液,调节pH值为9.6,在4℃条件下静止8-12小时后,去除缓冲液;
在酶标板的每孔中加入200μl封闭液,在4℃条件下封闭2小时后,去除封闭液;
在酶标板的每孔中加入80ul样品稀释液和20ul血清或血浆样品,在室温下反应30分钟后,去除稀释液;
加入200ul缓冲液和50ul酶分解底物,混合反应2分钟后,测定OD值;
绘制酶活性-OD值标准曲线,算得待测样品中LP-PLA2酶活性;
加入酶标抗体试剂100μl,置37℃继续温育30分钟;
在酶标板的每孔中加入显色底物A液和显色底物B液各50μl混匀,37℃避光显色15分钟后,每孔加终止液50μl,混匀后10分钟内,测定校准品和待检样品的OD值;
以校准品抗原浓度为横坐标、校准品相应的OD值为纵坐标绘制标准曲线,并将待测样品OD值代入标准曲线中,算得待测样品中LP-PLA2浓度。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述计算出血液样品中LP-PLA2酶活性包括:
用纯对硝基酚为标准品,分别制备出0、10、20、40、80和120nmol/ml的对硝基酚标准品,测定出不同浓度对硝基酚标准品的OD值,绘制出对硝基酚标准品浓度与OD值关系标准曲线,计算出曲线斜率(K):
K=(对硝基酚80nmol-40nmol/ml)/(80nmol/ml OD值-40nmol/ml OD值);
50、100、200和400ng/ml浓度LP-PLA2与酶底物反应,产生对硝基酚,呈颜色反应,测定不同反应时间(2,3,4,5,6,7,8min)OD值,根据以下公式算出LP-PLA2酶活性单位:
LP-PLA2酶活性单位(IU,nmol/ml/min)=K(OD3min-OD2min)/0.02ml。