一种用于检测单个金纳米颗粒表面生物分子的装置及方法与流程

本发明涉及生物分子及构象的检测技术领域，具体涉及一种用于检测单个金纳米颗粒表面生物分子的装置及方法。

背景技术：

在与疾病相关的生物分子检测发展与应用过程中，人们对于检测方法的灵敏度，检测极限，便携度提出了越来越高的要求。例如核酸的检测中，传统的pcr方法和设备难以实现短周期，小型化的检测；与肿瘤诊断相关的肿瘤标志物的检测中，标志物含量很低，传统方法如放射免疫分析等用到放射性同位素，对人体和环境均有损害，并且操作繁琐。近些年微纳米技术的发展，为解决上述与疾病相关的生物分子检测方面的问题提供了机遇。

金纳米颗粒是近年研究最为广泛的纳米材料之一，它具有良好的生物相容性、化学稳定性以及独特的光学性质，在生物分子检测、诊断和治疗方面具有很大的发展潜力。尤其是金纳米颗粒显示出特殊的局域表面等离子体共振特性(localizedsurfaceplasmonresonance，lspr)。在外界电磁场作用下，金纳米颗粒表面的自由电子产生极化，当外界电磁场发生交替时，金纳米颗粒表面电子的极化方向也发生交替变化，这使得自由电子也随着产生往复运动，当电磁场的变化频率与金属纳米颗粒表面自由电子的固有运动频率相等时会产生共振使得表面等离子体的集体震荡大幅度增强，导致金纳米颗粒表面产生强电磁场，并最终增强了诸如吸收和散射的辐射特性。

金纳米颗粒的表面等离子共振频率会随着颗粒的大小，颗粒间的距离，周围环境的介电常数等因素发生变化。因此，我们可以将金纳米颗粒用来传感一些生物分子如蛋白质、dna的存在及其构象变化。

局域表面等离子体共振在很多领域都有应用，但大多数都是应用的暗场显微镜进行检测。比如最基本的通过检测金纳米颗粒的吸收峰位移，就可以判断出其周围介质的变化。先在金纳米颗粒表面通过金硫键修饰上带巯基的检测单链dna，当体系中加入与之互补的目标dna时，dna杂交，导致金纳米颗粒表面的介电常数发生改变，从而使得金纳米颗粒的等离基元吸收峰发生红移。通过ccd光谱仪收集散射光，根据散射光红移的程度可以实时追踪dna杂交过程。但是单颗粒的检测本身噪声就是很大的，而在dna构象变化过程中收集全光谱再进行数据拟合，找到峰位移的方法，不确定度比较大。因为变化过程中金纳米颗粒的局域等离子体吸收红移的程度也是比较小的，文献报道的吸收峰红移量达到最大值也只有2.0nm。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种高灵敏度、高信噪比、少试剂量、半自动化的用于金纳米颗粒表面生物分子及构象的检测装置及方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种用于检测单个金纳米颗粒表面生物分子的装置，所述装置包括光热系统、用于寻找和选择单个金纳米颗粒的暗场显微镜、放置在暗场显微镜样品台上的微流控芯片样品以及用于检测光信号的雪崩二极管，所述光热系统发射加热光和检测光并聚焦在微流控芯片样品上，从微流控芯片样品中反射出来的检测光原路返回至雪崩二极管中，所述加热光和检测光到达微流控芯片样品处时共焦点。本发明的装置采用暗场显微镜，可以找出微流控芯片样品中比较合适的单个金纳米颗粒，然后对该单个金纳米颗粒进行单独分析。通过将加热光和检测光共焦点，当微流控芯片样品吸收加热光后会形成类似热透镜，从而引起检测光的发散角度以及偏振方向的变化，所以通过分析检测光的变化即可知样品中金纳米颗粒所处的微环境情况。

所述的光热系统包括检测光发射单元以及加热光发射单元，所述检测光发射单元发射出的检测光和加热光发射单元发射出的加热光在二向色镜处重合，聚焦在微流控芯片样品上。

所述的加热光发射单元包括依次设置的绿色激光器、斩波器、一号偏振片、一号1/2波片以及一号扩束器，一号扩束器得到的加热光射在二向色镜上，并通过二向色镜的反射聚焦在微流控芯片样品上。绿色激光器发出的激光的波长为520～550nm。

所述的加热光为圆偏振光，加热光的频率为400～1000hz，加热光的功率为0～50mw。

所述的检测光发射单元包括依次设置在的红色激光器、二号偏振片、二号1/2波片、二号扩束器及分光棱镜，所述分光棱镜中射出检测光透过二向色镜，并和加热光重合，然后聚焦在微流控芯片样品上，检测光聚焦到微流控芯片样品后原路返回，并透过二向色镜到达分光棱镜，然后射入雪崩二极管中，获得光热信号。红色激光器发出的激光的波长为620～650nm。

所述的检测光为线偏振光。

所述的微流控芯片样品包括底层的石英载玻片、中间的pdms层以及覆盖在pdms层上方的盖玻片，待检测金纳米颗粒覆载在盖玻片上，所述石英载玻片和pdms层通过等离子键合，所述盖玻片与pdms层通过吸附力结合。

所述的pdms层通过铸造模具然后浇筑而成，所述pdms层的中央设置直径为8mm的贮液腔体，在贮液腔体的两侧分别设置直径为1mm的进液孔和出液孔，所述进液孔通过宽度为0.4mm、深度为0.1mm的进液流道槽与贮液腔体连通，所述出液孔通过度为0.2mm、深度为0.1mm的出液流道槽与贮液腔体连通，采用不同宽度的进液流道槽和出液流道槽，营造一定的流速差为了让中间贮液腔体的液体可以充满，所述盖玻片覆盖住贮液腔体并露出进液孔和出液孔。

本装置将微小的波长移动通过检测光转化为偏振方向和光强的变化，结合使用锁相放大器对信号进行降噪处理，可以提高灵敏度和信噪比。

一种采用如上所述检测装置进行的检测单个金纳米颗粒表面生物分子的方法，包括以下几个步骤：

(1)将裸露的金纳米颗粒覆载在盖玻片的底部下表面，然后将盖玻片覆盖在pdms层上且裸露的金纳米颗粒位于贮液腔体内，得到微流控芯片样品，并将微流控芯片样品放置在暗场显微镜的样品台上；

(2)选定合适的单个裸露的金纳米颗粒，然后光热系统向微流控芯片样品发射加热光和检测光，并通过雪崩二极管检测该单个裸露的金纳米颗粒的光热信号；

(3)通过蠕动泵向pdms层的进液孔中加入带有生物分子的溶液，然后光热系统向微流控芯片样品发射检测光和加热光，通过雪崩二极管实时监测生物分子修饰上金纳米颗粒表面过程中其光热信号的变化；

(4)通过蠕动泵向pdms层进液孔中加入缓冲液，将未修饰上金纳米颗粒表面的多余的生物分子的溶液冲洗掉，再通过蠕动泵加入能够诱导生物分子构象发生变化的溶液，然后光热系统向微流控芯片样品发射检测光和加热光，通过雪崩二极管实时监测生物分子在金纳米颗粒表面构象变化过程中其光热信号的变化；

(5)分析步骤(2)、(3)和(4)中各光热信号的变化，得到生物分子的类型及构象变化的信息。

目前分析化学和生物的检测极限就是单分子。系综水平的分子具有复杂的构象动力学，分子交互以及空间分散现象，很多这种特性通过统计平均结果得到，这就缺失了在分子和纳米尺度下的信息。而单颗粒水平的研究能够发现系综水平所不能发现的，如分子层次和纳米尺度的机理与信息。知道分子动力学的细节对我们在分子水平上理解生物功能是很有必要的。然而，目前很少实验仪器可以给我们提供平台去检测溶液中分子的活动，通常都是使用荧光标记物，分析物的标记修饰可能会影响生物进程，这促使着无标记的新检测方法诞生。本方法使用单个金纳米颗粒检测未标记的生物分子，具有非常高的分辨率和信噪比。

光热法是使用两束不同波长的激光，会被样品吸收的激光为加热光，不会的为检测光，当样品吸收能量温度升高后会形成类似热透镜，从而引起检测光的发散角度以及偏振方向的变化，所以通过分析检测光的变化即可知样品中金纳米颗粒所处的微环境情况。可以通过此方法实时监测检测区域的物质的变化，而且由于这种方法无需接触到样品，是一种非侵入式的检测方法，同时具备高灵敏度和信噪比。在单分子pti文章中有记载，光热法的信噪比可以达到15，灵敏度相对于传统的暗场显微镜方法可以增强700倍.这也是我们运用光热法检测生物分子的原因。

所述生物分子的溶液中含有手性生物分子或具有构象变化的生物分子。

多肽具有手性，但是单分子的光热效应小而且在紫外区域，金纳米颗粒光热效应高但是不具有手性，将多肽修饰在金纳米颗粒表面，使得整理在可见光区域具有手性，将加热光调制为圆偏振光并且实现左旋和右旋圆偏振光的快速切换，生物分子对左旋和右旋圆偏振光的吸收程度差异会引起分子光热信号变化，达到检测吸光度差值的目的。由于金纳米颗粒的光热信号相对很强所以会使得整体对左旋和右旋光的吸收程度差异变大。这比传统的圆二色谱法具有更高的灵敏度，可以应用于更低的浓度，具有更高的信噪比。

富含碱基g的单链dna，通过巯基-金化学键原位修饰在金纳米颗粒表面，进一步通过蠕动泵切换液体为含钾离子的缓冲液，诱导ssdna形成g4结构。dna的修饰和g4的形成，都增加了金纳米颗粒周边的环境的折射率，导致了金纳米颗粒的吸收峰发生红移，从而会改变光热信号。因此我们借助较容易测量的光热信号变化，间接探测dna分子在金纳米颗粒表面的修饰过程，以及后续由钾离子诱导的dna构象变化。传统的用暗场显微镜观察结合ccd收集全光谱再进行数据拟合，找到峰位移的方法，不确定度比较大。该方法信噪比和灵敏度都有很大程度的提升。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下几方面：

(1)通过本装置检测单个纳米金颗粒上生物分子及其构象的变化，检测灵敏度高；

(2)在雪崩二极管后面连接锁相放大器进行信号的降噪处理，可以提高灵敏度和信噪比；

(3)采用特殊的微流控芯片样品，用较小的剂量，就可以实现生物分子及其构象的原位、实时检测。

附图说明

图1为本发明装置的连接示意图；

图2为本发明微流控芯片样品的结构示意图；

图3为实施例1中步骤(2)的检测结果；

图4为实施例1中加入dna和缓冲溶液后光热信号的检测图。

其中，1为绿色激光器，2为斩波器，3为一号偏振片，4为一号1/2波片，5为一号扩束器，6为红色激光器，7为二号偏振片，8为二号1/2波片，9为二号扩束器，10为分光棱镜，11为二向色镜，12为暗场显微镜，13为雪崩二极管，14为锁相放大器，15为反射镜，16为盖玻片，17为石英载玻片，18为pdms层，19为贮液腔体，20为进液孔，21为进液流道槽，22为出液孔，23为出液流道槽。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

一种用于检测单个金纳米颗粒表面生物分子的装置，其结构如图1所示，包括光热系统、用于寻找单个金纳米颗粒的暗场显微镜12、放置在暗场显微镜12样品台上的微流控芯片样品以及用于检测光信号的雪崩二极管13，光热系统包括检测光发射单元以及加热光发射单元，检测光发射单元发射出的检测光和加热光发射单元发射出的加热光经过二向色镜11整合后，照射在微流控芯片样品上。

加热光发射单元包括依次设置的绿色激光器1、斩波器2、一号偏振片3、一号1/2波片4以及一号扩束器5，一号扩束器5得到的加热光射在二向色镜11上，并通过二向色镜11的反射射在微流控芯片样品上。加热光为圆偏振光，加热光的频率为400～1000hz，加热光的功率为0～50mw。

检测光发射单元包括依次设置在的红色激光器6、二号偏振片7、二号1/2波片8、二号扩束器9及分光棱镜10，分光棱镜10中射出检测光透过二向色镜11，并和加热光重合，然后射在微流控芯片样品上，检测光照射到微流控芯片样品后原路返回，并透过二向色镜11到达分光棱镜10，然后射入雪崩二极管13中，获得光信号。检测光为线偏振光。本装置为了减小占地面积，采用若干反射镜15改变激光的传递方向，本实施例激光改变的角度均为90°。

本装置将微小的波长移动通过检测光转化为偏振方向和光强的变化，结合使用锁相放大器14对信号进行降噪处理，可以提高灵敏度和信噪比。

其中，微流控芯片样品的结构如图2所示，包括底层的石英载玻片17、中间的pdms层18以及覆盖在pdms层18上方的盖玻片16，待检测金纳米颗粒覆载在盖玻片16上，石英载玻片17和pdms层18通过等离子键合，盖玻片16与pdms层18通过吸附力结合。pdms层18通过铸造模具然后浇筑而成，pdms层18的中央设置直径为8mm的贮液腔体19，在贮液腔体19的两侧分别设置直径为1mm的进液孔20和出液孔，进液孔20通过宽度为0.4mm、深度为0.1mm的进液流道槽21与贮液腔体19连通，出液孔通过宽度为0.2mm、深度为0.1mm的出液流道槽23与贮液腔体19连通，采用不同宽度的进液流道槽21和出液流道槽23，营造一定的流速差为了让中间贮液腔体19的液体可以充满，盖玻片16覆盖住贮液腔体19并露出进液孔20和出液孔22。

采用上述装置进行单个金纳米颗粒表面生物分子的检测，包括以下几个步骤：

(1)选取空白盖玻片，并对盖玻片进行清洗，清洗流程是：依次在以下液体中超声30min，2％hellmanex洗液；超纯水；丙酮；超纯水；甲醇；超纯水，以去除盖玻片表面的有机物，灰尘等。高纯氮气吹干后浓硫酸中浸泡12h后再超纯水中超声30min，高纯氮气吹干后备用；然后将盖玻片进行表面处理：将盖玻片浸入硅烷偶联剂的甲醇(光谱级)溶液中6小时。其中，硅烷偶联剂的甲醇溶液，使用体积百分比浓度为5％的3-氨丙基三乙氧基硅烷，然后依次在甲醇(光谱级)和超纯水中超声30min，高纯氮气吹干后备用。该硅烷化处理为了让盖玻片表面带氨基基团，便于后续与金纳米颗粒的覆载；将经表面处理过的盖玻片在一定体积的金纳米颗粒水溶液中浸泡24h左右，使盖玻片的表面自组装形成一层裸露的金纳米颗粒，然后将盖玻片覆盖在pdms层上且裸露的金纳米颗粒位于贮液腔体内，并将pdms层覆盖在石英载玻片上，得到微流控芯片样品，并将微流控芯片样品放置在暗场显微镜的样品台上；

(2)通过暗场显微镜选定合适的单个裸露的金纳米颗粒，然后光热系统向微流控芯片样品发射检测光，将加热光光斑与微流控芯片样品上的单个金纳米颗粒重合，并通过雪崩二极管检测该单个裸露的金纳米颗粒的光热信号；

(3)通过蠕动泵向pdms层的进液孔中加入带有生物分子的溶液，然后光热系统向微流控芯片样品发射检测光和加热光，通过雪崩二极管实时检测生物分子修饰上金纳米颗粒表面这个过程中光热信号的变化；本实施例以富含碱基g的单链dna为例，选择一个可以形成g4的dna序列，用tris-hcl(10mmph＝7.40)缓冲液配制成2μm的dna贮存液，将其通过蠕动泵注入微流控芯片贮液腔体后，dna会通过巯基-金化学键原位修饰在金纳米颗粒表面，

(4)通过蠕动泵向pdms层进液孔中加入浓度为500nm的含钾离子的缓冲液，将带有生物分子的溶液全部替换，然后光热系统向微流控芯片样品发射检测光和加热光，通过雪崩二极管检测单链dna在钾离子存在的情况下发生团簇形成g-四链体过程中光热信号的变化；

(5)分析步骤(2)、(3)和(4)中个反射光信号的变化，得到生物分子的类型信息。

其中，图3为步骤2的检测结果，从图中可以看出，同一个样品上金纳米颗粒处(gnp)光热信号随加热光功率增加而增加，而空白背景处(background)光热信号几乎不随加热光变化而变化，证明信号确实是来自于金纳米颗粒的光热信号。

如图4所示，在该实验中，我们对单个金纳米颗粒进行了溶液中原位的dna修饰，发现单颗粒的光热信号在tris-hcl缓冲溶液中基本保持稳定，有微小变化。当引入dna溶液之后，信号开始缓慢持续地降低，在大约90分钟时信号降低到最低值附近，维持稳定。这是因为dna分子修饰在金纳米颗粒表面之后，纳米颗粒周围的有效折射率变大，造成lspr的谱峰红移，同时也降低了纳米颗粒对激发光的吸收，从而信号降低。