一种烟草及烟气中烟碱手性异构体的分析方法与流程

本发明属于烟草化学成分分析领域，涉及一种烟草及烟气中烟碱手性异构体的分析方法，具体涉及一种烟用原料、卷烟、电子烟烟液、加热不燃烧卷烟及上述物质的烟气中烟碱手性异构体的超高效合相色谱的分析方法。

背景技术：

烟碱是烟草和烟气中含量最丰富的生物碱，可作用于人体中枢神经系统，是吸烟者吸烟的主要动力。烟碱含有一个手性中心，存在两个对映体：S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱，两者在烟草中含量、代谢机理和生理特性完全不同。天然烟草中的烟碱主要为S-(-)-构型，但通过高灵敏度的分析技术，可在不同类型的烟草原料中检测到占总烟碱含量1％以内的R-(+)-烟碱。

目前，关于烟碱的手性分析方法主要有毛细管电泳法、核磁共振法、二维气相色谱法、二维液相色谱法、高效液相色谱法及气相色谱质谱联用法等。方法灵敏度与S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱的分离度密切相关；同时基于烟草较为复杂的基质，有效排除杂质干扰是方法准确度的保证。

超高效合相色谱结合了超临界流体色谱技术，兼具传统超高效液相色谱的优点，以超临界流体CO₂为流动相主体，依靠流动相的溶剂化能力来进行分离。由于超临界流体CO₂具有低粘度、高扩散速率和高质量转移能力的特点，其在手性化合物及相似物分离领域具有独特优势。目前，未见关于合相色谱用于烟用原料、卷烟、电子烟烟液、加热不燃烧卷烟及上述物质的烟气中烟碱的手性分析报道。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种烟草及烟气中烟碱手性异构体的分析方法，对烟用原料、卷烟、电子烟烟液、加热不燃烧卷烟及上述物质的烟气进行前处理方法研究和超高效合相色谱条件优化，建立了烟碱手性异构体的超高效合相色谱的分析方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种烟草及烟气中烟碱手性异构体的分析方法，具体包括以下步骤：

优选地，所述烟碱手性异构体为S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱。

1)样品前处理：对烟草样品进行处理，获得待测液，所述烟草样品选自液态、固态或气态的烟草样品中的一种；

优选地，步骤1)中，所述液态的烟草样品为电子烟烟液。

优选地，步骤1)中，所述液态的烟草样品的处理为：将液态的烟草样品加入有机溶剂稀释，获得待测液。

更优选地，所述液态的烟草样品与有机溶剂加入的体积之比为1:0-1000。进一步优选地，所述液态的烟草样品与有机溶剂加入的体积之比为1:10-100。

优选地，步骤1)中，所述固态的烟草样品为烟用原料，所述烟用原料选自烟叶、烟梗、烟用薄片或烟丝中的任意一种。

更优选地，所述烟丝为卷烟烟丝或加热不燃烧卷烟烟丝。

优选地，步骤1)中，所述固态的烟草样品的处理为：将固态的烟草样品磨粉后加入NaOH溶液和甲基叔丁基醚，充分振荡后静置，取上层清液过滤后加入有机溶剂稀释，获得待测液。

更优选地，所述NaOH溶液为重量百分比为5-15％NaOH水溶液。进一步优选地，所述NaOH溶液为重量百分比为10％NaOH水溶液。

更优选地，所述固态的烟草样品加入质量(g)与NaOH溶液加入的体积(mL)之比为1:1-5。进一步优选地，所述固态的烟草样品加入质量(g)与NaOH溶液加入的体积(mL)之比为1:2。

更优选地，所述固态的烟草样品加入质量(g)与甲基叔丁基醚加入的体积(mL)之比为1:2-8。进一步优选地，所述固态的烟草样品加入质量(g)与甲基叔丁基醚加入的体积(mL)之比为1:4。

更优选地，所述振荡时间为4-6min。进一步优选地，所述振荡时间为5min。

更优选地，所述静置条件为：静置温度为室温；静置时间为20-28h。进一步优选地，所述静置条件为：静置温度为20-25℃；静置时间为22-26h。

更优选地，所述上层清液与有机溶剂加入的体积之比为1:0-50。进一步优选地，所述上层清液与有机溶剂加入的体积之比为1:0-10。

优选地，步骤1)中，所述气态的烟草样品选自卷烟烟气、电子烟烟气、加热不燃烧卷烟烟气中的任意一种。

优选地，步骤1)中，所述气态的烟草样品的处理为：将气态的烟草样品抽吸后用滤片捕集烟气，再将滤片用有机溶剂振荡萃取后过滤，获得待测液。

更优选地，所述气态的烟草样品抽吸采用吸烟机进行。进一步优选地，所述吸烟机为常规使用的吸烟机，可在市场上购买获得，具体如SM450直线型吸烟机或RM20H转盘式吸烟机。

更优选地，所述滤片捕集的烟气粒相物采用的有机溶剂萃取体积为5-100mL/每张滤片。

更优选地，所述滤片为剑桥滤片。进一步优选地，所述剑桥滤片的规格为Φ44mm或Φ92mm中的一种。

更优选地，所述振荡萃取条件为：振荡时间：25-35min；振荡频率：140-160r/min。进一步优选地，所述振荡萃取条件为：振荡时间：30min；振荡频率：150r/min。其中，所述单位r/min中r是指一个完整振荡循环的次数。

更优选地，所述过滤方式为滤膜过滤方式。进一步优选地，所述滤膜的孔径为0.45μm。

更优选地，所述有机溶剂为正己烷与异丙醇的混合溶液，所述正己烷与异丙醇加入的体积之比为6-8:2-4。

进一步优选地，所述正己烷与异丙醇加入的体积之比为7:3。

2)标准溶液的配制：

A、取烟碱标准品用有机溶剂溶解并定容，配成标准储备溶液；

B、分别移取不同量的步骤A中的标准储备溶液，用有机溶剂稀释定容为一系列不同浓度的标准溶液。

更优选地，步骤A中，所述烟碱标准品为S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的混合标准品，所述S-(-)-烟碱与R-(+)-烟碱的质量之比为1:1。所述烟碱标准品称为外消旋烟碱标准品。

更优选地，步骤A和/或B中，所述有机溶剂为正己烷与异丙醇的混合溶液，所述正己烷与异丙醇加入的体积之比为6-8:2-4。

进一步优选地，所述正己烷与异丙醇加入的体积之比为7:3。

更优选地，步骤B中，所述标准溶液中烟碱手性异构体成分的浓度范围为：S-(-)-烟碱为1-1000μg/mL；R-(+)-烟碱为1-1000μg/mL。

进一步优选地，所述标准溶液中烟碱手性异构体成分的浓度范围为：S-(-)-烟碱为1-500μg/mL；R-(+)-烟碱为1-500μg/mL。

3)样品定性检测：分别将步骤1)配制的待测液和步骤2)中标准溶液进行超高效合相色谱检测，比较保留时间进行定性，确定待测液中烟碱手性异构体成分；

4)样品定量检测：分别将步骤1)配制的待测液和步骤2)中标准溶液进行超高效合相色谱检测，采用外标法进行定量，获得待测液中烟碱手性异构体的含量。

优选地，步骤3)和/或4)中，所述超高效合相色谱检测的条件为：色谱柱：改性多聚糖固定相手性色谱柱；柱温：30-50℃；流速：1.2-1.4mL/min；进样量：1-10μL；PDA紫外检测波长：255-265nm；进样室温度：5-15℃；背压：1500-1700psi；流动相：超临界CO₂流体-含异丙胺的甲醇溶液，其中，A相为超临界CO₂流体，B相为含体积百分比为0.6-1.0％异丙胺的甲醇溶液；分析时间：7.0min；梯度洗脱。

更优选地，所述超高效合相色谱检测的条件为：色谱柱：Prototype UPC² CEL1改性多聚糖固定相手性色谱柱(3.0×150mm，2.5μm)；柱温：40℃；流速：1.3mL/min；进样量：2μL；PDA紫外检测波长：260nm；进样室温度：10℃；背压：1600psi；流动相：超临界CO₂流体-含异丙胺的甲醇溶液，其中，A相为超临界CO₂流体，B相为含体积百分比为0.8％异丙胺的甲醇溶液；分析时间：7.0min；梯度洗脱。

更优选地，所述梯度洗脱程序的具体为：

0-0.5min，A相：B相体积比为98：2-98：2；

0.5-5.0min，A相：B相体积比为98：2-90：10；

5.0-5.2min，A相：B相体积比为90：10-98：2；

5.2-7.0min，A相：B相体积比为98：2-98：2。

优选地，所述外标法是指：分别将步骤2)所述一系列不同浓度的标准溶液，采用超高效合相色谱进样分析，分别获得标准溶液中S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱含量与峰面积的线性关系，分别以S-(-)-烟碱或R-(+)-烟碱色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到上述各标准工作曲线的回归方程。再将待测液采用超高效合相色谱检测，将获得的待测液中S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱的色谱峰面积，分别代入相应标准工作曲线的回归方程中，可得到相应烟碱手性异构体成分的含量。

如上所述，本发明提供的一种烟草及烟气中烟碱手性异构体的分析方法，以烟碱为研究对象，对液态、固态、气态的烟草样品进行前处理方法研究和超高效合相色谱条件优化，建立了烟碱中手性异构体成分：S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的超高效合相色谱分析方法。本发明中分析方法能完全实现S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的基线分离，在实际样品中两者分离度均可达2.5以上。本发明中分析方法中，在烟碱两个对映体出峰范围能有效排除杂质干扰，实现样品中烟碱手性组成的准确测定。本发明中分析方法简便快速，灵敏度高，重复性好，能够完全满足烟用原料、卷烟、电子烟烟液、加热不燃烧卷烟等及上述物质的烟气中烟碱手性异构体组成分析需要。

附图说明

图1显示为本发明中外消旋烟碱(即S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱各占50％)标准样品的超高效合相色谱图。

图2显示为本发明中香料烟烟末萃取液中S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的超高效合相色谱图。

图3显示为本发明中电子烟烟液中S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的超高效合相色谱图。

图4显示为本发明中成品卷烟主流烟气粒相物萃取液中S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的超高效合相色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

以下实施例使用的试剂和仪器如下：

1、试剂

电子烟烟液(市售商品化的电子烟烟液)；白肋烟烟叶、香料烟烟叶、烤烟烟叶、成品卷烟烟丝、加热不燃烧卷烟烟丝(市售)；卷烟烟气、电子烟烟气、加热不燃烧卷烟烟气(市售卷烟、电子烟、加热不燃烧卷烟点燃后抽吸的烟气)；外消旋烟碱标准品(S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱各占50wt％，美国Sigma公司)；正己烷、甲醇、异丙醇、甲基叔丁基醚、异丙胺(色谱纯，Amethyst Chemicals公司)；氢氧化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；超临界CO₂流体(超高效合相色谱制备)。

2、仪器

ACQUITY UPC²型超高效合相色谱(美国Waters公司)，配备二极管阵列检测器；SM450直线型吸烟机(英国CERULEAN公司)；RM20H转盘式吸烟机(德国Borgwaldt公司)。

实施例1

1、样品前处理

取液态的电子烟烟液加入正己烷与异丙醇的混合溶液进行稀释，获得待测液。其中，正己烷与异丙醇的混合溶液中，正己烷与异丙醇加入的体积之比为7:3。电子烟烟液与正己烷与异丙醇的混合溶液加入的体积之比为1:10-100。

2、标准溶液的配制

称取一定量的外消旋烟碱标准品，外消旋烟碱标准品中S-(-)-烟碱与R-(+)-烟碱的质量之比为1:1，采用正己烷与异丙醇的混合溶液溶解并定容，先配成标准储备溶液。再移取不同量的标准储备溶液，采用正己烷与异丙醇的混合溶液稀释定容为一系列不同浓度的标准溶液。标准溶液中S-(-)-烟碱的浓度范围为1-500μg/mL，R-(+)-烟碱的浓度范围为1-500μg/mL。其中，正己烷与异丙醇的混合溶液中，正己烷与异丙醇加入的体积之比为7:3。

3、测定

分别将上述步骤1中配制的待测液和步骤2中的标准溶液进行超高效合相色谱检测，比较保留时间进行定性，确定待测液中烟碱手性异构体成分：S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱；同时采用外标法进行定量，获得待测液中烟碱手性异构体成分：S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱的含量。具体检测结果见图1、3。由图1、3可知，本发明中方法对电子烟烟液中烟碱手性异构体的分离效果非常好。

具体测定时，所述外标法是指：分别将步骤2所述一系列不同浓度的标准溶液，采用超高效合相色谱进样分析，分别获得标准溶液中S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱含量与峰面积的线性关系，分别以S-(-)-烟碱或R-(+)-烟碱色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到上述各标准工作曲线的回归方程。再将待测液采用超高效合相色谱检测，将获得的待测液中S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱的色谱峰面积，分别代入相应标准工作曲线的回归方程中，可得到相应烟碱手性异构体成分的含量。

其中，所述超高效合相色谱检测的条件为：色谱柱：Prototype UPC² CEL1改性多聚糖固定相手性色谱柱(3.0×150mm，2.5μm)；柱温：40℃；流速：1.3mL/min；进样量：2μL；PDA紫外检测波长：260nm；进样室温度：10℃；背压：1600psi；流动相：超临界CO₂流体-含异丙胺的甲醇溶液，其中，A相为超临界CO₂流体，B相为含体积百分比为0.8％异丙胺的甲醇溶液；分析时间：7.0min；梯度洗脱。

所述梯度洗脱程序的具体为：

0-0.5min，A相：B相体积比为98：2-98：2；

0.5-5.0min，A相：B相体积比为98：2-90：10；

5.0-5.2min，A相：B相体积比为90：10-98：2；

5.2-7.0min，A相：B相体积比为98：2-98：2。

实施例2

1、样品前处理

取液态的电子烟烟液加入正己烷与异丙醇的混合溶液进行稀释，获得待测液。其中，正己烷与异丙醇的混合溶液中，正己烷与异丙醇加入的体积之比为6-8:2-4。电子烟烟液与正己烷与异丙醇的混合溶液加入的体积之比为1:0-1000。

2、标准溶液的配制

称取一定量的外消旋烟碱标准品，外消旋烟碱标准品中S-(-)-烟碱与R-(+)-烟碱的质量之比为1:1，采用正己烷与异丙醇的混合溶液溶解并定容，先配成标准储备溶液。再移取不同量的标准储备溶液，采用正己烷与异丙醇的混合溶液稀释定容为一系列不同浓度的标准溶液。标准溶液中S-(-)-烟碱的浓度范围为1-1000μg/mL，R-(+)-烟碱的浓度范围为1-1000μg/mL。其中，正己烷与异丙醇的混合溶液中，正己烷与异丙醇加入的体积之比为6-8:2-4。

3、测定

分别将上述步骤1中配制的待测液和步骤2中的标准溶液进行超高效合相色谱检测，比较保留时间进行定性，确定待测液中烟碱手性异构体成分：S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱；同时采用外标法进行定量，获得待测液中烟碱手性异构体成分：S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱的含量。具体检测结果见图1、3。由图1、3可知，本发明中方法对电子烟烟液中烟碱手性异构体的分离效果非常好。

具体测定时，所述外标法是指：分别将步骤2所述一系列不同浓度的标准溶液，采用超高效合相色谱进样分析，分别获得标准溶液中S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱含量与峰面积的线性关系，分别以S-(-)-烟碱或R-(+)-烟碱色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到上述各标准工作曲线的回归方程。再将待测液采用超高效合相色谱检测，将获得的待测液中S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱的色谱峰面积，分别代入相应标准工作曲线的回归方程中，可得到相应烟碱手性异构体成分的含量。

其中，所述超高效合相色谱检测的条件为：所述超高效合相色谱检测的条件为：色谱柱：改性多聚糖固定相手性色谱柱；柱温：30-50℃；流速：1.2-1.4mL/min；进样量：1-10μL；PDA紫外检测波长：255-265nm；进样室温度：5-15℃；背压：1500-1700psi；流动相：超临界CO₂流体-含异丙胺的甲醇溶液，其中，A相为超临界CO₂流体，B相为含体积百分比为0.6-1.0％异丙胺的甲醇溶液；分析时间：7.0min；梯度洗脱。

所述梯度洗脱程序的具体为：

0-0.5min，A相：B相体积比为98：2-98：2；

0.5-5.0min，A相：B相体积比为98：2-90：10；

5.0-5.2min，A相：B相体积比为90：10-98：2；

5.2-7.0min，A相：B相体积比为98：2-98：2。

实施例3

1、样品前处理

取固态的烟草样品，为烟用原料，烟用原料选自烟叶、烟梗、烟用薄片或烟丝中的任意一种，其中，烟丝为卷烟烟丝或加热不燃烧卷烟烟丝，烟叶为白肋烟烟叶、香料烟烟叶、烤烟烟叶中的任意一种。将固态的烟草样品磨粉后，取1g样品置于15mL试管中，加入10％NaOH水溶液2mL及甲基叔丁基醚4mL，旋紧旋盖，充分振荡5min后，室温20-25℃静置22-26h过夜。取上层清液经0.45μm滤膜过滤后加入正己烷与异丙醇的混合溶液进行稀释，获得待测液。其中，正己烷与异丙醇的混合溶液中，正己烷与异丙醇加入的体积之比为7:3。上层清液与上层清液加入的体积之比为1:0-10。样品平行测定三次。

2、标准溶液的配制

称取一定量的外消旋烟碱标准品，外消旋烟碱标准品中S-(-)-烟碱与R-(+)-烟碱的质量之比为1:1，采用正己烷与异丙醇的混合溶液溶解并定容，先配成标准储备溶液。再移取不同量的标准储备溶液，采用正己烷与异丙醇的混合溶液稀释定容为一系列不同浓度的标准溶液。标准溶液中S-(-)-烟碱的浓度范围为1-500μg/mL，R-(+)-烟碱的浓度范围为1-500μg/mL。其中，正己烷与异丙醇的混合溶液中，正己烷与异丙醇加入的体积之比为7:3。

3、测定

分别将上述步骤1中配制的待测液和步骤2中的标准溶液进行超高效合相色谱检测，比较保留时间进行定性，确定待测液中烟碱手性异构体成分：S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱；同时采用外标法进行定量，获得待测液中烟碱手性异构体成分：S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱的含量。具体检测结果见图1、2。由图1、2可知，本发明中方法对固态的烟草样品中烟碱手性异构体的分离效果非常好。

具体测定时，所述外标法是指：分别将步骤2所述一系列不同浓度的标准溶液，采用超高效合相色谱进样分析，分别获得标准溶液中S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱含量与峰面积的线性关系，分别以S-(-)-烟碱或R-(+)-烟碱色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到上述各标准工作曲线的回归方程。再将待测液采用超高效合相色谱检测，将获得的待测液中S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱的色谱峰面积，分别代入相应标准工作曲线的回归方程中，可得到相应烟碱手性异构体成分的含量。

其中，所述超高效合相色谱检测的条件为：色谱柱：Prototype UPC² CEL1改性多聚糖固定相手性色谱柱(3.0×150mm，2.5μm)；柱温：40℃；流速：1.3mL/min；进样量：2μL；PDA紫外检测波长：260nm；进样室温度：10℃；背压：1600psi；流动相：超临界CO₂流体-含异丙胺的甲醇溶液，其中，A相为超临界CO₂流体，B相为含体积百分比为0.8％异丙胺的甲醇溶液；分析时间：7.0min；梯度洗脱。

所述梯度洗脱程序的具体为：

0-0.5min，A相：B相体积比为98：2-98：2；

0.5-5.0min，A相：B相体积比为98：2-90：10；

5.0-5.2min，A相：B相体积比为90：10-98：2；

5.2-7.0min，A相：B相体积比为98：2-98：2。

实施例4

1、样品前处理

取固态的烟草样品，为烟用原料，烟用原料选自烟叶、烟梗、烟用薄片或烟丝中的任意一种，其中，烟丝为卷烟烟丝或加热不燃烧卷烟烟丝，烟叶为白肋烟烟叶、香料烟烟叶、烤烟烟叶中的任意一种。将固态的烟草样品磨粉后，取1g样品置于15mL试管中，加入5-15％NaOH水溶液1-5mL及甲基叔丁基醚2-8mL，旋紧旋盖，充分振荡4-6min后，室温静置20-28h过夜。取上层清液经0.45μm滤膜过滤后加入正己烷与异丙醇的混合溶液进行稀释，获得待测液。其中，正己烷与异丙醇的混合溶液中，正己烷与异丙醇加入的体积之比为6-8:2-4。上层清液与有机溶剂加入的体积之比为1:0-50。

2、标准溶液的配制

称取一定量的外消旋烟碱标准品，外消旋烟碱标准品中S-(-)-烟碱与R-(+)-烟碱的质量之比为1:1，采用正己烷与异丙醇的混合溶液溶解并定容，先配成标准储备溶液。再移取不同量的标准储备溶液，采用正己烷与异丙醇的混合溶液稀释定容为一系列不同浓度的标准溶液。标准溶液中S-(-)-烟碱的浓度范围为1-1000μg/mL，R-(+)-烟碱的浓度范围为1-1000μg/mL。其中，正己烷与异丙醇的混合溶液中，正己烷与异丙醇加入的体积之比为6-8:2-4。

3、测定

分别将上述步骤1中配制的待测液和步骤2中的标准溶液进行超高效合相色谱检测，比较保留时间进行定性，确定待测液中烟碱手性异构体成分：S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱；同时采用外标法进行定量，获得待测液中烟碱手性异构体成分：S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱的含量。具体检测结果见图1、2。由图1、2可知，本发明中方法对固态的烟草样品中烟碱手性异构体的分离效果非常好。

具体测定时，所述外标法是指：分别将步骤2所述一系列不同浓度的标准溶液，采用超高效合相色谱进样分析，分别获得标准溶液中S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱含量与峰面积的线性关系，分别以S-(-)-烟碱或R-(+)-烟碱色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到上述各标准工作曲线的回归方程。再将待测液采用超高效合相色谱检测，将获得的待测液中S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱的色谱峰面积，分别代入相应标准工作曲线的回归方程中，可得到相应烟碱手性异构体成分的含量。

其中，所述超高效合相色谱检测的条件为：所述超高效合相色谱检测的条件为：色谱柱：改性多聚糖固定相手性色谱柱；柱温：30-50℃；流速：1.2-1.4mL/min；进样量：1-10μL；PDA紫外检测波长：255-265nm；进样室温度：5-15℃；背压：1500-1700psi；流动相：超临界CO₂流体-含异丙胺的甲醇溶液，其中，A相为超临界CO₂流体，B相为含体积百分比为0.6-1.0％异丙胺的甲醇溶液；分析时间：7.0min；梯度洗脱。

所述梯度洗脱程序的具体为：

0-0.5min，A相：B相体积比为98：2-98：2；

0.5-5.0min，A相：B相体积比为98：2-90：10；

5.0-5.2min，A相：B相体积比为90：10-98：2；

5.2-7.0min，A相：B相体积比为98：2-98：2。

实施例5

1、样品前处理

取气态的烟草样品，为卷烟烟气、电子烟烟气、加热不燃烧卷烟烟气中的任意一种。

针对卷烟烟气样品，使用RM20H转盘式吸烟机进行卷烟抽吸后，再使用Φ92mm的剑桥滤片捕集烟气。再收集滤片，每张滤片用50mL正己烷与异丙醇的混合溶液在150r/min下振荡萃取30min，萃取液经经0.45μm滤膜过滤后，获得待测液。每个样品平行测定三次。其中，正己烷与异丙醇的混合溶液中，正己烷与异丙醇加入的体积之比为7:3。

针对电子烟烟气样品，使用RM20H转盘式吸烟机进行抽吸50口后，再使用Φ44mm的剑桥滤片捕集电子烟烟气。再收集滤片，每张滤片用5mL正己烷与异丙醇的混合溶液在150r/min下振荡萃取30min，萃取液经经0.45μm滤膜过滤后，获得待测液。每个样品平行测定三次。其中，正己烷与异丙醇的混合溶液中，正己烷与异丙醇加入的体积之比为7:3。

针对加热不燃烧卷烟烟气样品，使用SM450直线型抽烟机进行加热不燃烧卷烟抽吸，后，再使用Φ44mm的剑桥滤片捕集烟气。再收集滤片，每张滤片用5mL正己烷与异丙醇的混合溶液在150r/min下振荡萃取30min，萃取液经经0.45μm滤膜过滤后，获得待测液。每个样品平行测定三次。其中，正己烷与异丙醇的混合溶液中，正己烷与异丙醇加入的体积之比为7:3。

2、标准溶液的配制

称取一定量的外消旋烟碱标准品，外消旋烟碱标准品中S-(-)-烟碱与R-(+)-烟碱的质量之比为1:1，采用正己烷与异丙醇的混合溶液溶解并定容，先配成标准储备溶液。再移取不同量的标准储备溶液，采用正己烷与异丙醇的混合溶液稀释定容为一系列不同浓度的标准溶液。标准溶液中S-(-)-烟碱的浓度范围为1-500μg/mL，R-(+)-烟碱的浓度范围为1-500μg/mL。其中，正己烷与异丙醇的混合溶液中，正己烷与异丙醇加入的体积之比为7:3。

3、测定

分别将上述步骤1中配制的待测液和步骤2中的标准溶液进行超高效合相色谱检测，比较保留时间进行定性，确定待测液中烟碱手性异构体成分：S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱；同时采用外标法进行定量，获得待测液中烟碱手性异构体成分：S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱的含量。具体检测结果见图1、4。由图1、4可知，本发明中方法对气态的烟草样品中烟碱手性异构体的分离效果非常好。

具体测定时，所述外标法是指：分别将步骤2所述一系列不同浓度的标准溶液，采用超高效合相色谱进样分析，分别获得标准溶液中S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱含量与峰面积的线性关系，分别以S-(-)-烟碱或R-(+)-烟碱色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到上述各标准工作曲线的回归方程。再将待测液采用超高效合相色谱检测，将获得的待测液中S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱的色谱峰面积，分别代入相应标准工作曲线的回归方程中，可得到相应烟碱手性异构体成分的含量。

其中，所述超高效合相色谱检测的条件为：色谱柱：Prototype UPC² CEL1改性多聚糖固定相手性色谱柱(3.0×150mm，2.5μm)；柱温：40℃；流速：1.3mL/min；进样量：2μL；PDA紫外检测波长：260nm；进样室温度：10℃；背压：1600psi；流动相：超临界CO₂流体-含异丙胺的甲醇溶液，其中，A相为超临界CO₂流体，B相为含体积百分比为0.8％异丙胺的甲醇溶液；分析时间：7.0min；梯度洗脱。

所述梯度洗脱程序的具体为：

0-0.5min，A相：B相体积比为98：2-98：2；

0.5-5.0min，A相：B相体积比为98：2-90：10；

5.0-5.2min，A相：B相体积比为90：10-98：2；

5.2-7.0min，A相：B相体积比为98：2-98：2。

实施例6

1、样品前处理

取气态的烟草样品，为卷烟烟气、电子烟烟气、加热不燃烧卷烟烟气中的任意一种。将气态的烟草样品使用吸烟机进行抽吸后，再使用剑桥滤片捕集烟气。再收集滤片，每张滤片用5-100mL正己烷与异丙醇的混合溶液在140-160r/min下振荡萃取25-35min，萃取液经0.45μm滤膜过滤后，获得待测液。其中，正己烷与异丙醇的混合溶液中，正己烷与异丙醇加入的体积之比为6-8:2-4。

2、标准溶液的配制

称取一定量的外消旋烟碱标准品，外消旋烟碱标准品中S-(-)-烟碱与R-(+)-烟碱的质量之比为1:1，采用正己烷与异丙醇的混合溶液溶解并定容，先配成标准储备溶液。再移取不同量的标准储备溶液，采用正己烷与异丙醇的混合溶液稀释定容为一系列不同浓度的标准溶液。标准溶液中S-(-)-烟碱的浓度范围为1-1000μg/mL，R-(+)-烟碱的浓度范围为1-1000μg/mL。其中，正己烷与异丙醇的混合溶液中，正己烷与异丙醇加入的体积之比为6-8:2-4。

3、测定

分别将上述步骤1中配制的待测液和步骤2中的标准溶液进行超高效合相色谱检测，比较保留时间进行定性，确定待测液中烟碱手性异构体成分：S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱；同时采用外标法进行定量，获得待测液中烟碱手性异构体成分：S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱的含量。具体检测结果见图1、4。由图1、4可知，本发明中方法对气态的烟草样品中烟碱手性异构体的分离效果非常好。

具体测定时，所述外标法是指：分别将步骤2所述一系列不同浓度的标准溶液，采用超高效合相色谱进样分析，分别获得标准溶液中S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱含量与峰面积的线性关系，分别以S-(-)-烟碱或R-(+)-烟碱色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到上述各标准工作曲线的回归方程。再将待测液采用超高效合相色谱检测，将获得的待测液中S-(-)-烟碱、R-(+)-烟碱的色谱峰面积，分别代入相应标准工作曲线的回归方程中，可得到相应烟碱手性异构体成分的含量。

其中，所述超高效合相色谱检测的条件为：色谱柱：改性多聚糖固定相手性色谱柱；柱温：30-50℃；流速：1.2-1.4mL/min；进样量：1-10μL；PDA紫外检测波长：255-265nm；进样室温度：5-15℃；背压：1500-1700psi；流动相：超临界CO₂流体-含异丙胺的甲醇溶液，其中，A相为超临界CO₂流体，B相为含体积百分比为0.6-1.0％异丙胺的甲醇溶液；分析时间：7.0min；梯度洗脱。

所述梯度洗脱程序的具体为：

0-0.5min，A相：B相体积比为98：2-98：2；

0.5-5.0min，A相：B相体积比为98：2-90：10；

5.0-5.2min，A相：B相体积比为90：10-98：2；

5.2-7.0min，A相：B相体积比为98：2-98：2。

实施例7

分别移取不同体积的如实施例1的步骤2所示外消旋烟碱标准品的标准储备溶液，采用正己烷与异丙醇的混合溶液(v/v＝7:3)稀释定容，配制为一系列不同浓度的标准溶液。其中，标准溶液中S-(-)-烟碱的浓度分别为2、5、10、20、50、100、200、500μg/mL，标准溶液中R-(+)-烟碱的浓度分别为2、5、10、20、50、100、200、500μg/mL。

将上述配制好的一系列不同浓度的标准溶液分别进行超高效合相色谱检测，以色谱峰面积为纵坐标(Y轴)，其相应烟碱手性异构体的质量浓度为横坐标(X轴)，进行回归分析，得到回归方程及其相关系数，以3倍信噪比为检测限，得到方法的检测限，具体结果如表1所示。

由表1可知，回归方程的在2～500μg/mL浓度范围内进样时线性关系良好，相关系数R²>0.9995。由于两个对映体之间具有良好的分离度，其方法的检测限可达0.5μg/mL，具有较高的方法灵敏度。

表1方法学考察：线性、检测限

y：峰面积；x：浓度

实施例8

取外消旋烟碱标准样品按实施例1的步骤1进行前处理，再按实施例1的步骤3的条件进行测定，分别重复平行检测5次(n＝5)，结果见表2。由表2可以看出，外消旋烟碱标准样品中R-(+)-烟碱的相对标准偏差(RSD)为0.11％。而根据现有的烟碱手性异构体分析表述方式，主要以R-(+)-烟碱占总烟碱的百分比来表示烟碱手性组成，总烟碱中除R-(+)-烟碱以外均为S-(-)-烟碱。所以本发明中测定方法的精密度较好，重复性佳。

表2方法学考察：精密度(n＝5)

^*R-(+)-烟碱的平均质量百分占比(相对于总烟碱含量)

实施例9

采用本方法测定不同形态的12种烟草样品的烟碱手性组成，重复测定3次(n＝3)，具体结果见表3。由表3可知，不同形态的烟草样品中R-(+)-烟碱相对总烟碱含量的平均质量百分占比为0.186-2.62％，R-(+)-烟碱的相对标准偏差(RSD)为2.21-7.30％。而根据现有的烟碱手性异构体分析表述方式，主要以R-(+)-烟碱占总烟碱的百分比来表示烟碱手性组成，总烟碱中除R-(+)-烟碱以外均为S-(-)-烟碱。从而表明针对不同的形态的烟草样品，该方法均能有效测定其实际样品中烟碱手性异构体成分的含量，方法操作简便、适用性好，结果准确、可靠。

表3烟草及烟气样品中烟碱手性组分分析结果(n＝3)

^*R-(+)-烟碱的平均质量百分占比(相对于总烟碱含量)

所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。