一种替格瑞洛手性异构体含量的高效液相色谱检测方法与流程

本发明属于药物化学中的分析监测
技术领域：
，更具体地讲，涉及一种替格瑞洛手性异构体含量的高效液相色谱检测方法。
背景技术：
：替格瑞洛(ticagrelor)是由阿斯利康公司(AstraZeneca)研发的一种新型的、具有选择性的小分子抗凝血药，其化学结构式如下式1所示：替格瑞洛分子结构中含有6个手性碳原子，在实际合成过程中和储藏过程中会产生杂质，其中手性异构体杂质是其主要杂质之一，而常规的分析检测方法很难分离众多的手性异构体杂质。已有文献或专利报道采用纤维素类(或多糖衍生物)为填充剂的手性色谱柱检测的方法，但均为硅胶表面涂敷纤维素类(或多糖衍生物)的柱子，此类柱子平衡时间较长、稳定性不好、重现性较差、柱子寿命较短，且无法使用二氯甲烷、三氯甲烷等溶剂为流动相。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种能够有效检测替格瑞洛中手性异构体含量并保证药物安全性和质量可靠性的替格瑞洛手性异构体含量的高效液相色谱检测方法。本发明公开了一种替格瑞洛手性异构体含量的高效液相色谱检测方法，采用以硅胶表面键合纤维素-三(3,5-二氯苯氨基甲酸酯)为填充剂的手性色谱柱，以低级烷烃-低级醇的混合溶液为流动相A，以二氯甲烷和/或氯仿为流动相B。根据本发明替格瑞洛手性异构体含量的高效液相色谱检测方法的一个实施例，所述检测方法具体包括以下步骤：a)分别称取替格瑞洛对照品和替格瑞洛手性异构体对照品，利用无水乙醇溶解并稀释制成每1ml中约含替格瑞洛1mg、各手性异构体2μg的系统适用性溶液；b)称取替格瑞洛样品，利用无水乙醇配制成每1ml中含1mg替格瑞洛的供试品溶液；c)利用无水乙醇将所述供试品溶液稀释1000倍作为对照溶液；d)分别取步骤a)、步骤b)、步骤c)的溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪并进行测定，记录色谱图，完成替格瑞洛手性异构体的测定，采用主成份自身对照法对替格瑞洛手性异构体的含量进行计算；根据本发明替格瑞洛手性异构体含量的高效液相色谱检测方法的一个实施例，流动相的流速为0.8～1.2ml/min，色谱柱柱温为22～28℃；检测器为紫外检测器，检测波长为250～350nm。根据本发明替格瑞洛手性异构体含量的高效液相色谱检测方法的一个实施例，所述低级烷烃为正己烷、正戊烷、环己烷和正庚烷中的至少一种，所述低级醇为异丙醇、甲醇和乙醇中的至少一种，所述低级烷烃-低级醇的混合溶液中低级烷烃与低级醇的体积比为100:10～120:10。根据本发明替格瑞洛手性异构体含量的高效液相色谱检测方法的一个实施例，所述流动相A为正己烷-异丙醇-甲醇的混合溶液，其中，正己烷-异丙醇-甲醇的体积比为(300～330):(17～12):(17～12)。根据本发明替格瑞洛手性异构体含量的高效液相色谱检测方法的一个实施例，所述手性色谱柱为IC、IA和IB手性色谱柱中的一种。根据本发明替格瑞洛手性异构体含量的高效液相色谱检测方法的一个实施例，按照下表所示的梯度进行洗脱：根据本发明替格瑞洛手性异构体含量的高效液相色谱检测方法的一个实施例，替格瑞洛的手性异构体为下表所列的七种结构所示物质：根据本发明替格瑞洛手性异构体含量的高效液相色谱检测方法的一个实施例，流动相的流速为1ml/min，检测波长为300nm，手性色谱柱为IC，色谱柱柱温为22℃、25℃或28℃。本发明采用高效液相色谱法并利用手性色谱柱对替格瑞洛手性异构体进行分离，式1中替格瑞洛的化合物色谱峰能有效的和其七种手性异构体实现分离，而且采用自身对照法进行杂质的定量测定，操作简便、检测成本低且具有良好的灵敏度、线性、专属性、精密度、准确度、稳定性和耐用性，是控制替格瑞洛异构体的一种行之有效的检测方法，从而保证了替格瑞洛产品质量和患者用药安全。附图说明图1示出了实施例1中采用本发明的检测方法对系统适用性溶液检测得到的HPLC图。图2示出了实施例1中采用本发明的检测方法对供试品溶液检测得到的HPLC图。图3示出了对比例1中检测方法对系统适用性溶液检测得到的HPLC图。图4示出了对比例2中检测方法对系统适用性溶液检测得到的HPLC图。图5示出了对比例3中检测方法对系统适用性溶液检测得到的HPLC图。图6示出了对比例4中检测方法对系统适用性溶液检测得到的HPLC图。具体实施方式本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。本说明书中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。下面将对本发明替格瑞洛手性异构体含量的高效液相色谱检测方法进行详细地说明。根据本发明的示例性实施例，本发明采用以硅胶表面键合纤维素-三(3,5-二氯苯氨基甲酸酯)为填充剂的手性色谱柱，以低级烷烃-低级醇的混合溶液为流动相A，以二氯甲烷和/或氯仿为流动相B。本发明通过采用更稳定的硅胶表面键合纤维素-三(3,5-二氯苯氨基甲酸酯)为填充剂的手性色谱柱，解决硅胶表明涂敷纤维素类(或多糖衍生物)色谱柱寿命短，容易被试剂损伤(试剂的等级要求较高)，耐用性较差的问题。虽然涂敷型色谱柱和键合型色谱柱仅仅是其固定相的固定方式存在差异，但是其对化合物的选择性存在明显的差异，因而属于完全不同的色谱柱。替格瑞洛分子结构中含有6个手性碳原子，在实际合成过程中和储藏过程中会产生杂质，其中手性异构体杂质是其主要杂质之一，而常规的分析检测方法很难分离众多的手性异构体杂质。而手性分离色谱柱众多，主要是纤维素类、蛋白类，多糖，冠醚类。纤维素色谱柱主要分为涂敷型和键合型色谱柱，而目前替格瑞罗手性方法主要为涂敷型色谱柱，此类色谱柱溶剂兼容性窄，对溶剂以及稀释剂有较大的限制；对流动相等级要求较高，部分国内厂家试剂无法满足分析要求；寿命较短，从而造成色谱柱更换的耐用性较差。键合型色谱柱相对于涂敷型色谱柱，新增加的溶剂种类，给键合相特殊的选择能力。因此本公司开发了键合相替格瑞罗手性开发方法，扩充了溶剂种类，可以兼容二氯甲烷和/或氯仿等大多数有机溶剂，因此不仅提高化合物的溶解性，同时也增加了对化合物独特的选择性，所以能够有效分离替格瑞洛众多的异构体杂质。而键合相色谱柱固有的稳定性和和耐用性，更增加了检测方法的稳定性和重现性，从而使本发明远好于目前采用涂敷型色谱柱方法。其中，替格瑞洛的化学结构式如下式1所示：并且，替格瑞洛的手性异构体为下表1所列的七种结构所示物质：表1替格瑞洛的七种手性异构体结构低级烷烃可以为正己烷、正戊烷、环己烷和正庚烷中的至少一种，低级醇可以为异丙醇、甲醇和乙醇中的至少一种，低级烷烃-低级醇的混合溶液中低级烷烃与低级醇的体积比为100:10～120:10。根据本发明的优选实施例，采用的流动相A为正己烷-异丙醇-甲醇的混合溶液，其中，正己烷-异丙醇-甲醇的体积比为(300～330):(17～12):(17～12)。本发明采用硅胶表面键合纤维素-三(3,5-二氯苯氨基甲酸酯)为填充剂的手性色谱柱(如：IC、IA和IB手性色谱柱中的任何一种)。具体地，本发明的检测方法可以具体包括以下步骤：a)分别称取替格瑞洛对照品和替格瑞洛手性异构体对照品，利用无水乙醇溶解并稀释制成每1ml中约含替格瑞洛1mg、各手性异构体2μg的系统适用性溶液；b)称取替格瑞洛样品，利用无水乙醇配制成每1ml中含1mg替格瑞洛的供试品溶液；c)利用无水乙醇将所述供试品溶液稀释1000倍作为对照溶液；d)分别取步骤a)、步骤b)、步骤c)的溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪并进行测定，记录色谱图，完成替格瑞洛手性异构体的测定，采用主成份自身对照法对替格瑞洛手性异构体的含量进行计算；其中，高效液相色谱的检测条件具体为：流动相的流速为0.8～1.2ml/min，色谱柱柱温为22～28℃；检测器为紫外检测器，检测波长为250～350nm。进一步优选地，流动相的流速为1ml/min，检测波长为300nm，手性色谱柱为IC，色谱柱柱温为25℃。洗脱时，优选地采用下表2所示的梯度进行洗脱。表2洗脱程序根据现有要替格瑞洛生产路线和化合物的稳定性特点，主要控制7种手性异构体杂质，本发明采用高效液相色谱法并结合特定手性色谱柱进行分离，式1中替格瑞洛的化合物色谱峰能有效地和其7种手性异构体实现分离，而且，采用自身对照法进行杂质定量测定，操作简便、检测成本低且具有良好的灵敏度和专属性，是辅助控制替格瑞洛手性异构体含量的有效检测方法，从而保证了替格瑞洛的产品质量和患者用药安全。下面将结合具体实施例和试验例对本发明替格瑞洛手性异构体含量的高效液相色谱检测方法的制备方法作进一步说明。实施例1：检测仪器：岛津LC-2030高效液相色谱仪。色谱条件：色谱柱为IC柱(250×4.6mm，5μm)，色谱柱柱温为25℃；采用紫外检测器，检测波长设置为300nm；流动相流速为1.0ml/min；以正己烷-异丙醇-甲醇(330:15:15)为流动相A，以二氯甲烷为流动相B，洗脱条件如下表3所示：表3实施例1的洗脱条件实验步骤：取替格瑞洛样品适量，加无水乙醇溶解并稀释制成每1ml中约含1mg替格瑞洛的溶液，作为供试品溶液；量取供试品溶液适量，用无水乙醇稀释制成每1ml中约含1μg替格瑞洛的溶液作为对照溶液；另称取替格瑞洛手性异构体对照品：异构体A+异构体B、异构体C+异构体D、异构体E、异构体F和异构体G各适量，分别加入无水乙醇溶解并稀释制成一定浓度的贮备液，另称取替格瑞洛对照品适量，精密加入上述各杂质对照品的贮备液适量，用无水乙醇溶解并稀释制成每1ml中约含替格瑞洛1mg、各异构体2μg的溶液，作为系统适用性溶液。分别取各溶液10μl并注入液相色谱仪，采用上述色谱检测条件检测，记录色谱图。图1示出了实施例1中采用本发明的检测方法对系统适用性溶液检测得到的HPLC图，图2示出了实施例1中采用本发明的检测方法对供试品溶液检测得到的HPLC图。如图1和图2所示，在本发明的色谱条件下替格瑞洛和各手性异构体能有效分离且相邻手性异构体的最小分离度为1.64，替格瑞洛中无其它手性异构体杂质干扰检测。对比例1：检测仪器：岛津LC-2030高效液相色谱仪。色谱条件：色谱柱为AD-H柱(250×4.6mm，5μm)；以正己烷-无水乙醇(80:20)为流动相；色谱柱柱温为30℃；采用紫外检测器；检测波长设置为300nm；流动相流速为1.0ml/min。实验步骤：按实施步骤1方法配制系统适用性溶液。取系统适用性溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图3。由色谱图3可以看出，在该色谱条件下替格瑞洛和相邻的手性异构体分离度只有1.15，并且有异构体和主峰位置重叠且平衡时间较长。对比例2：检测仪器：岛津LC-2030高效液相色谱仪。色谱条件：色谱柱为IC柱(250×4.6mm，5μm)，色谱柱柱温为21℃；采用紫外检测器，检测波长设置为300nm；流动相流速为1.0ml/min；以正己烷-无水乙醇-异丙醇(85:10:5)为流动相；实验步骤：按实施步骤1方法配制系统适用性溶液。取系统适用性溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图4。由色谱图4可以看出，在该色谱条件下替格瑞洛出峰处有异构体未被分离，相邻异构体分离度只有1.18。对比例3：检测仪器：岛津LC-2030高效液相色谱仪。色谱条件：色谱柱为IC柱(250×4.6mm，5μm)，色谱柱柱温为30℃；采用紫外检测器，检测波长设置为300nm；流动相流速为1.0ml/min；以正己烷-异丙醇-甲醇(330:15:15)为流动相A，以二氯甲烷为流动相B，洗脱条件如下表4所示：表4对比例3的洗脱条件实验步骤：按实施步骤1方法配制系统适用性溶液。取系统适用性溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图5，由色谱图5可以看出，在该色谱条件下替格瑞洛峰型变差、响应变低，并且其与相邻手性异构体的分离度只有1.157，未达到1.5的分离度。对比例4：检测仪器：岛津LC-2030高效液相色谱仪。色谱条件：色谱柱为IC柱(250×4.6mm，5μm)，色谱柱柱温为30℃；采用紫外检测器，检测波长设置为300nm；流动相流速为1.0ml/min；以无水乙醇为流动相A，以二氯甲烷为流动相B，洗脱条件如下表5所示：表5对比例4的洗脱条件时间(min)流动相A(％)流动相B(％)0955608020实验步骤：按实施步骤1方法配制系统适用性溶液。取系统适用性溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图6，从色谱图6可以看出在该色谱条件下，替格瑞洛的保留时间太短且仅为3.818，并且其与手性异构体杂质不能实现有效分离。为了进一步说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例。试验例主要用于进行本发明检测方法的方法学研究，其中，本试验例中各种试验均采用如下条件：色谱柱：IC，250×4.6mm，5μm；色谱柱柱温为30℃；采用紫外检测器，检测波长设置为300nm；流动相流速为1.0ml/min；以无水乙醇为流动相A，以二氯甲烷为流动相B，洗脱条件如下表6所示：表6试验例的洗脱条件时间(min)流动相A(％)流动相B(％)093720861440703045703045.0193760937溶剂：无水乙醇；进样体积：10μl。专属性试验取替罗瑞洛样品进行酸(0.1mol/L2天)、碱(0.1mol/L2天)、氧化(3％双氧水2天)、强光(5000LX30天)、紫外光(30天)、高温(60℃下30天)、高湿(92.5％下30天)等强制降解试验后用无水乙醇配制成每1ml中约1mg替格瑞洛的供试品溶液。精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见下表7所示：表7试验例中专属性试验结果表7的试验结果表明，样品破坏后未产生干扰手性异构体检测的杂质出现，破坏后产生的异构体能有效地在本发明的检测条件下检出。综上所述，本发明采用高效液相色谱法并利用手性色谱柱对替格瑞洛手性异构体进行分离，式1中替格瑞洛的化合物色谱峰能有效的和其七种手性异构体实现分离，而且采用自身对照法进行杂质的定量测定，操作简便、检测成本低且具有良好的灵敏度、线性、专属性、精密度、准确度、稳定性和耐用性，是控制替格瑞洛异构体的一种行之有效的检测方法，从而保证了替格瑞洛产品质量和患者用药安全。本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。当前第1页1 2 3