基于靶标蛋白诱导DNA酶循环生成的均相免疫分析方法与流程

一、技术领域

本发明为一种基于靶标蛋白诱导dna酶循环生成的均相免疫分析方法，用于对靶标蛋白的简单、快速、灵敏检测。通过制备抗体-dna偶联物，利用夹心免疫识别反应产生邻位效应，诱导核酸杂交、链取代、dna酶生成及核酸外切酶iii循环放大，使得大量dna酶在位生成，通过dna酶对tmb显色剂或化学发光底物的催化，利用比色或化学发光成像的方法对靶标蛋白进行灵敏的定量分析。

二、

背景技术：

免疫分析因具有良好的特异性已广泛用于临床疾病诊断、食品安全检测、环境监测等领域。最常见的免疫分析方法有酶联免疫分析、电化学免疫分析、荧光免疫分析和化学发光免疫分析，虽然这些免疫分析方法具有高的检测灵敏度，但它们通常为异相分析，需要在固体基底如96孔板、磁性纳米粒子、载玻片等上固定捕获抗体，然后通过两步夹心免疫反应修饰上信号分子，最后加入底物进行检测。上述过程至少需要2步清洗分离过程，另外，由于是异相免疫反应，温育时间比较长，导致整个分析过程耗时长、操作复杂、成本高、大多情况下需要专业技术人员操作专用仪器，不适合现场检测。因此，迫切需要开发简单、快速、便宜、灵敏的免疫分析方法。

比色免疫分析由于其成本低、简单、实用的特性得到了广泛的关注，尤其是通过裸眼读数即可实现实时半定量分析，使其在野外检测、现场诊断方面具有极大优势。传统的比色免疫分析中，常常把酶标记在二抗上，通过显色反应来检测，灵敏度低。为了提高灵敏度，近年来发展了等离子体比色法，即利用酶催化纳米粒子(如金纳米粒子、银纳米粒子)的增长或刻蚀，使纳米粒子的大小、形状、分布或组成成分发生变化，从而实现颜色的变化。虽然这些方法大大提高了检测灵敏度，但是一些物理或化学因素会极大地影响纳米粒子的聚集和酶的活性，如ph值、离子强度、温度、其他杂质等。此外，标记酶的过程相当复杂，使酶的催化活性大大降低。上述这些因素不可避免地影响了比色免疫分析的准确度和重现性，限制了其在实际样品检测中的应用。因此采用新颖的设计，构建无纳米粒子、无标记的可视化检测平台是非常有必要的。

邻位诱导效应通过免疫反应使一对与抗体偶联的dna间距离拉近，进而引发dna组装、触发级联dna组装并产生检测信号，使对蛋白质的检测转化为对dna的检测。通过与各种dna信号放大技术相结合，可实现对蛋白质的灵敏检测。该方法可均相进行，简单、快速、灵敏。

本发明结合邻位免疫反应、dna链取代反应、核酸外切酶放大技术，设计了一种靶标蛋白诱导dna酶循环生成的均相免疫分析方法。由于dna酶具有很好的类辣根过氧化物酶性质，可以催化tmb显色或者鲁米诺发光，所以该均相免疫分析方法可以通过比色或者化学发光成像进行检测。该方法快速直观、步骤简单、灵敏度高，在临床分析中具有很大的应用前景。

三、

技术实现要素：

本发明的内容是：合成抗体-dna偶联物，结合邻位诱导效应、dna链取代反应和核酸外切酶放大技术，发展了一种靶标蛋白诱导dna酶循环生成的均相免疫分析方法，通过比色或者化学发光成像检测，实现了靶标蛋白的简单、快速、高灵敏检测。

本发明通过以下技术方案来实现：

合成抗体1-dna1和抗体2-dna2偶联物，并使dna3和dna4杂交形成双链dna，以上述制备的dna-抗体偶联物、dna3/dna4双链和血红素hemin、核酸外切酶iii混合后作为检测溶液，当加入待测样品时，抗体1-dna1和抗体2-dna2同时对靶标蛋白进行识别反应，使dna1与dna2距离靠近产生邻位杂交而形成复合物，该复合物可与双链dna上的dna3发生链取代反应，进而释放出富含g序列的dna4与hemin结合形成g-四链体/hemindna酶，在核酸外切酶iii的作用下上述dna酶生成过程可以循环进行(如图1)，基于dna酶对tmb显色反应或者鲁米诺化学发光的催化，通过比色或者化学发光成像方法实现对靶标蛋白的灵敏检测。

上述的抗体1-dna1、抗体2-dna2为对靶标蛋白特异的抗体与dna1、dna2的偶联物，其中dna1与dna2有6个碱基完全互补，如图2所示。

上述的dna3/dna4双链dna有23个碱基互补，同时dna3和dna4的3′端分别有7和6个碱基突出，用于抗核酸外切酶iii剪切，如图3所示。

上述的dna1与dna2形成的复合物与dna3的所有碱基完全互补，同时dna1的5′端和dna2的3′端分别有5个碱基突出，如图4所示。

上述的dna4为富g序列，在单链状态时能与hemin结合形成g-四链体/hemindna酶，进而催化tmb显色及鲁米诺化学发光。

上述的抗体1-dna1、抗体2-dna2与靶标蛋白形成的邻位复合物与dna3/dna4发生链取代反应，与dna3结合后使dna3的3′端凹陷，可被核酸外切酶剪切。

本检测系统测定靶标蛋白的原理：

本发明设计的基于靶标蛋白诱导dna酶循环生成的均相免疫分析方法，原理如图1所示：将含有靶标蛋白的样品溶液与含有抗体1-dna1、抗体2-dna2、dna3/dna4双链、血红素hemin、核酸外切酶iii的检测溶液混合，37℃下温育30分钟。温育过程中，靶标蛋白同时被抗体1和抗体2识别并发生夹心免疫反应，使得dna1和dna2相互靠近，在邻位效应下，dna1与dna2杂交形成复合物，该复合物可与双链dna上的dna3发生链取代反应，进而释放出富含g序列的dna4与hemin结合形成g-四链体/hemindna酶，在核酸外切酶iii的作用下上述dna酶生成过程可以循环进行，产生大量dna酶。温育完成后，加入tmb显示溶液，在避光条件下反应20分钟后通过裸眼及酶标仪检测，或者在温育完成后，加入鲁米诺-h2o2化学发光底物溶液，立即通过ccd拍照进行成像分析。溶液的吸光度或化学发光强度与靶标蛋白的浓度成正相关。用652nm处吸光度或化学发光强度对靶标浓度的对数作图，获得标准曲线，通过标准曲线测得样品溶液中靶标蛋白的浓度。

本发明与现有技术相比，具有以下特点：

本发明结合邻位效应、dna链取代反应、核酸外切酶放大技术，设计了一种简单、快速、灵敏的均相免疫新分析方法。相比于现有的免疫分析方法，具有以下特点：

(1)本方法为均相免疫分析方法，可通过样品与检测溶液的直接混合完成蛋白质的检测，无需固体生物识别载体和复杂的清洗、分离步骤，操作简单，成本低廉；

(2)该方法通过免疫识别激发邻位效应，进而进行dna链取代反应，产生信号实现对靶标蛋白的检测，所以通过使用相应的抗体-dna偶联物，该方法可普适性的应用于检测多种蛋白质；

(3)通过引入核酸外切酶iii的循环放大，在位生成大量dna酶，检测信号被放大，提高检测灵敏度，使得裸眼检测靶标蛋白的检测限可达亚ng/ml水平；

(4)信号读出简便，利用dna酶催化显色反应或化学发光反应，信号可由裸眼观察或比色、化学发光成像读出。

四、附图说明

图1.基于靶标蛋白诱导dna酶循环生成的均相免疫分析方法过程示意图

图2.夹心免疫反应诱导dna1与dna2邻位杂交示意图

图3.dna3/dna4双链dna的结构示意图

图4.夹心免疫复合物与dna3链取代反应后的结构示意图

五、具体实施方式

实施例1：结合附图1，以癌胚抗原cea为例，说明靶标蛋白诱导dna酶循环生成的均相免疫分析方法对蛋白质的检测：

(1)温育过程：将2μl不同浓度的cea标准溶液或者样品溶液与18μl反应液混合，其中dna3/dna4双链、hemin、核酸外切酶iii和抗体-dna偶联物的浓度分别为2μm、5μm、0.4u/μl和0.25μm，然后37℃下避光温育30分钟；

(2)裸眼半定量分析：向(1)温育液中加入180μltmb显色剂，室温避光反应20分钟，直接裸眼看溶液的颜色，样品溶液与标准溶液的颜色进行对比，实现半定量分析。

(3)比色分析：以酶标仪对(2)中加入显色剂避光反应后的溶液进行检测，采集其652nm处的吸光度，根据获得的吸光度画出cea的标准曲线和算出样品溶液中cea的浓度。

(4)化学发光成像分析：取5μl(1)中的温育液，加入45μl化学发光底物溶液，立即用ccd收集动态积分方式曝光15杪的化学发光信号，根据记录的化学发光值，获得cea的标准曲线和待测溶液中cea的浓度。