基于内嵌染料和DNA相互作用的石房蛤毒素的检测方法与流程

本发明涉及石房蛤毒素的检测研究，具体涉及一种基于内嵌染料和dna相互作用的石房蛤毒素的检测方法。

背景技术：

麻痹性贝毒素是一类神经毒素，毒性极强，能阻碍神经冲动的传导而使中枢神经系统受到抑制产生呼吸系统麻痹死亡。其中毒性最强的石房蛤毒素可以使人在15min内死亡，由于其不能被消化酶所破坏、无色无味，因此对其的检测研究尤为重要。传统的小鼠检测法及hplc后荧光分析检测技术由于受限于动物实验和大型仪器导致实际应用并不能广泛应用于日常。目前市面上所有的试剂盒均是以抗体为基的蛋白质试剂盒。受限于其稳定性和大规模制备的局限性，目前研发了dna为基的石房蛤毒素的识别技术。

通过selex(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)高通量筛选技术，handy,saram.等报道了第一例针对石房蛤毒素的dna序列aptstx1，(firstreportoftheuseofasaxitoxin-proteinconjugatetodevelopadnaaptamertoasmallmoleculetoxin,toxin,2013,61,30-37),而后郑欣等报道了针对第一例的改良版的dna序列m-30f(asaxitoxin-bindingaptamerwithhigheraffinityandinhibitoryactivityoptimizedbyrationalsite-directedmutagenesisandtruncation,toxin,2015,101,41-47)。

dna为基的生物传感识别元件具有易于大规模合成、修饰和设计的优点，因此被广泛用于传感器的制备与应用。通过dna构象变化可以与具有光、电、磁等信号的分子和仪器进行结合，达到利用dna构象变化对被检测物检测的目的。

然而从2013年发现针对石房蛤毒素的dna序列后，针对其序列的石房蛤毒素的传感器的设计报道却没有如其他检测物序列般迅猛增长。除了文章本身报道过程中所使用的bli检测仪器，目前利用上述两个序列报道的传感器只有电化学方法(amperometricaptasensorforsaxitoxinusingagoldelectrodemodifiedwithcarbonnanotubesonaself-assembledmonolayer,andmethyleneblueasanelectrochemicalindicatorprobe，2016,183,6,1971-1980)。究其原因，主要是两种序列长度较长，且二级结构较复杂，导致利用碱基配对和消除的替换、扩增、固定难以进行，而利用构象变化产生的光信号又由于序列本身的复杂性效果并不明显。

利用dna针对石房蛤毒素的传感器构建目前只有bli和电化学分析方法，这些方法均是采用表界面分析仪器对dna探针进行固定后对检测过程进行实时监测，强烈依赖仪器且周期较长，检测成本高，且仪器较难获得，因此需要找到一种普适的方法可以对研发的序列进行设计从而达到应用的目的。

技术实现要素：

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，提供一种能够摆脱传测定需要依赖复杂、高成本的仪器、且克服了需要对dna进行固定化和检测平台构建的复杂性的基于内嵌染料和dna相互作用的石房蛤毒素的检测方法。

技术方案：为实现上述目的，本发明提供一种基于内嵌染料和dna相互作用的石房蛤毒素的检测方法，包括以下具体步骤：

步骤1)：首先将dna溶解于缓冲液中并进行淬火处理；

步骤2)：然后向缓冲液中加入石房蛤毒素与dna进行相互作用，相互作用的时间为25min～35min；

步骤3)：待相互作用的时间到了，向步骤2)中的缓冲液中加入内嵌染料，等待25min～35min后，进行荧光光谱测定，通过所测光谱的峰值，对比标准曲线计算出石房蛤毒素的毒素浓度。

所述步骤3)中的内嵌染料具有可以识别和结合dna二级结构g-四链体的特征，由于所发现的dna序列均具有g-四链体二级构象特征，且研究发现石房蛤毒素具有嵌入dna序列所生成的g四链体构象的特点，因此石房蛤毒素的结合势必影响内嵌染料的嵌合作用，因此可通过这种作用对有无毒素及毒素浓度进行荧光鉴定。

进一步地，所述步骤1)中的缓冲液为tris-hcl缓冲液，且缓冲液的ph＝7。

进一步地，所述步骤3)中的内嵌染料为荧光紫或者孔雀绿。

进一步地，所述步骤3)中采用荧光分光光度计进行荧光光谱测定。

进一步地，所述dna和内嵌染料的含量比例为1:1。

进一步地，所述步骤3)中通过所测光谱的652nm处的峰值，对比标准曲线计算出石房蛤毒素的毒素浓度。

有益效果：本发明与现有技术相比，通过利用对荧光的测定就能实现对于石房蛤毒素的毒素浓度的定量测定，不需要复杂的仪器和检测平台构建，检测方式简单、快速、准确，从而摆脱了传测定需要依赖复杂、高成本的仪器的技术瓶颈，并且克服了需要对dna进行固定化和检测平台构建的复杂性。

附图说明

图1为光谱的峰值和荧光强度的曲线关系图；

图2为荧光强度和石房蛤毒素的毒素浓度之间的关系图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。

实施例1：

首先将1μm的dna溶解于ph＝7的10mm的tris-hcl缓冲液中并进行淬火处理，然后向tris-hcl缓冲液中加入石房蛤毒素与dna进行相互作用，相互作用的时间为25min，待相互作用的时间到了后，向tris-hcl缓冲液中加入1μm的荧光紫，等待25min后，利用荧光分光光度计进行荧光光谱测定，通过所测光谱的652nm处的峰值，对比标准曲线计算出石房蛤毒素的毒素浓度。

实施例2：

首先将1μm的dna溶解于ph＝7的10mm的tris-hcl缓冲液中并进行淬火处理，然后向tris-hcl缓冲液中加入石房蛤毒素与dna进行相互作用，相互作用的时间为35min，待相互作用的时间到了后，向tris-hcl缓冲液中加入1μm的荧光紫，等待35min后，利用荧光分光光度计进行荧光光谱测定，通过所测光谱的652nm处的峰值，对比标准曲线计算出石房蛤毒素的毒素浓度。

实施例3：

首先将1μm的dna溶解于ph＝7的10mm的tris-hcl缓冲液中并进行淬火处理，然后向tris-hcl缓冲液中加入石房蛤毒素与dna进行相互作用，相互作用的时间为30min，待相互作用的时间到了后，向tris-hcl缓冲液中加入1μm的荧光紫，等待30min后，利用荧光分光光度计进行荧光光谱测定，通过所测光谱的652nm处的峰值，对比标准曲线计算出石房蛤毒素的毒素浓度。

实施例4：

如图1为利用荧光分光光度计进行荧光光谱测定，得到的光谱的峰值和荧光强度的曲线关系图，图1中的曲线由上往下分别为dna和内嵌染料的含量比为0、0.3、0.5、1、1.5、1.8、2；

图2为所测光谱在656nm处的峰值的情况下，荧光强度和石房蛤毒素的毒素浓度之间的关系图；

通过图1在所测光谱在656nm处的峰值分别得到当dna和内嵌染料的含量比为0、0.3、0.5、1、1.5、1.8、2时的相应的荧光强度，然后根据图2对比得到相应的石房蛤毒素的毒素浓度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。