本发明涉及生化检测领域，具体的，涉及一种谷胱甘肽还原酶测定试剂测定试剂及其制备方法和应用。
背景技术：
谷胱甘肽还原酶(glutathionereductase)是一种利用还原型nad(p)将氧化型谷胱甘肽(gs－sg)催化反应成还原型(gsh)的酶。
在动植物组织、微生物、酵母中均可以见到，其反应是不可逆的。
鼠肝脏的酶几乎只能利用nadp作为补酶，但是在人的红血球的酶也利用nad进行作用。对胱氨酸和高胱氨酸均无作用。可从酵母中制取结晶物。植物组织中似乎可对脱氢酶和氧化酶的连结起作用。将谷胱甘肽还原酶gs－sg、nadp和叶绿体混合一起用光照射，就会放氧，这就是受人重视的希尔(hill)反应。大肠杆菌这种酶中含有黄素。
谷胱甘肽是一种重要的细胞抗氧化剂。缺失谷胱甘肽还原酶会使细胞对氧化剂和抗生素更为敏感。
传统的检测方法使用复溶液加干粉，试剂现溶现用，稳定性差，不适于全自动分析的要求，因此有必要开发一种新的具有良好稳定性和检测准确性的谷胱甘肽还原酶测定试剂。
技术实现要素：
本发明的目的是在于克服传统的谷胱甘肽还原酶测定方法存在的稳定性差的缺陷，提供一种在2-8℃开盖使用状态下和在2-8℃密闭避光存储条件下持续稳定的谷胱甘肽还原酶测定试剂。
本发明的另一个目的是在于提供上述谷胱甘肽还原酶测定试剂的制备方法和在测定中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种谷胱甘肽还原酶测定试剂，所述试剂包括试剂1和试剂2，所述试剂1的组成成分包括：缓冲液、氧化型谷胱甘肽、稳定剂a；试剂2的组成成分包括：缓冲液、还原型辅酶ⅱ、稳定剂b；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、碳酸盐缓冲液中的任一种；所述稳定剂a为乙二胺四乙酸二钠、氯化镁、山梨酸钾中的一种或两种以上的混合物；所述稳定剂b为蔗糖、抗坏血酸、牛血清白蛋白、山梨酸钾中的一种或两种以上的混合物。
其中：
所述试剂1中，氧化型谷胱甘肽的浓度为0.1-1mmol/l；缓冲液的终浓度为50-100mmol/l；稳定剂a的浓度为1-2g/l。
所述试剂2中，还原型辅酶ⅱ的浓度为0.1-1g/l；缓冲液的终浓度为100-500mmol/l；稳定剂b的浓度为1-10g/l。
进一步的技术方案：
还包括校准品，所述校准品的组成成分包括基质、纯品及稳定剂c，所述基质为缓冲液、酪蛋白、牛血清白蛋白中的一种或两种以上的混合物，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、碳酸盐缓冲液中的任一种；所述纯品为谷胱甘肽还原酶；所述稳定剂c为海藻糖、抗坏血酸、乙二胺四乙酸二钠中的一种两种以上的混合物。
其中：
在所述校准品中纯品的浓度为30-100u/l；稳定剂c的浓度为1-10g/l；当所述基质中含有缓冲液时，缓冲液的浓度为50-100mmol/l；当所述基质中含有酪蛋白时，酪蛋白的浓度为1-10g/l；当所述基质中含有牛血清白蛋白时，牛血清白蛋白的浓度为1-10g/l。
更进一步的：
所述试剂1的ph为7.0-8.0，试剂2的ph为9.0-10.0。
所述校准品的ph为7.5-8.0。
一种谷胱甘肽还原酶测定试剂的制备方法，包括如下步骤：
a)试剂1的配制：试剂1的制备过程中各成分的混合顺序没有特别要求，在室温条件下，直接将所述缓冲液、氧化型谷胱甘肽、稳定剂a进行同时、分批或分步混合，只要能得到均匀的稳定相即可，通过搅拌使混合更加均匀；
b)试剂2的配制：试剂2的配制是在室温条件下，按照缓冲液、稳定剂b、还原型辅酶ⅱ的顺序，依次混合，得到均匀的稳定相，通过搅拌使混合更加均匀；
c)校准品的配制：校准品的配制是在室温条件下，按照基质、稳定剂c、纯品的顺序，依次混合，得到均匀的稳定相，通过搅拌使混合更加均匀。
一种谷胱甘肽还原酶测定试剂在谷胱甘肽还原酶测定中的应用，包括如下步骤：将待测样本、试剂1、试剂2按照6μl：150μl：50μl的体积比(可根据试剂中主要成分的浓度和检测仪器的不同，按比例进行用量的调整)混匀后静置180-300秒，然后置于检测仪器中测量2-3分钟吸光度值(a)，计算每分钟吸光度变化率(△a/min)，其中：测试温度37℃、检测仪器主波长340nm、副波长405nm，光径1cm，使用纯化水和校准品进行线性校准，测量待测样本中谷胱甘肽还原酶的浓度。
其中：
所述待测样本为血清、血浆、校准品、质控品或其他含有谷胱甘肽还原酶的溶液，所述检测仪器为具有双试剂功能的全自动生化分析仪。
由于上述技术方案的应用，本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、通过上述技术方案，本发明所提供的谷胱甘肽还原酶测定试剂在2-8℃开盖使用状态下的稳定时间可以达到20-30天，在2-8℃密闭避光存储过程中的稳定时间可以达到10-15个月。
2、该发明使用方便、消除干扰明显、灵敏度高，对生化仪器管道无污染，使其在谷胱甘肽还原酶的准确、快速测定中有重要的意义。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的描述，但本发明并不限于下述实施例。
实施例一
一种谷胱甘肽还原酶测定试剂，所述试剂包括试剂1和试剂2，所述试剂1的组成成分包括：缓冲液、氧化型谷胱甘肽、稳定剂a，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，其终浓度为50mmol/l，所述稳定剂a为乙二胺四乙酸二钠、氯化镁、山梨酸钾的混合物，其中乙二胺四乙酸二钠、氯化镁和山梨酸钾的终浓度分别为1.5g/l，氧化型谷胱甘肽终浓度为0.5mmol/l；试剂2的组成成分包括：缓冲液、还原型辅酶ⅱ、稳定剂b，所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液，其终浓度为250mmol/l，稳定剂b为蔗糖、抗坏血酸、牛血清白蛋白、山梨酸钾的混合物，其中蔗糖、抗坏血酸、牛血清白蛋白、山梨酸钾的终浓度分别为5g/l，还原型辅酶ⅱ终浓度为0.5g/l；
该试剂还包括校准品，所述校准品的组成成分包括基质、纯品及稳定剂c，所述基质为缓冲液、酪蛋白和牛血清白蛋白的混合物，其中缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液，其终浓度为50mmol/l，所述酪蛋白、牛血清白蛋的终浓度分别为5g/l；所述纯品为谷胱甘肽还原酶，其终浓度为80u/l；所述稳定剂c为海藻糖、抗坏血酸的混合物，所述海藻糖、抗坏血酸终浓度分别为5g/l。
上述谷胱甘肽还原酶测定试剂的制备方法，包括如下步骤：
a)试剂1的配制：量取配制体积等体积的纯化水，选用磷酸盐缓冲液，其终浓度为50mmol/l，按配制体积计算并称取适量的磷酸盐加入，调节ph为7.5，按配制体积计算并称取适量的氧化型谷胱甘肽加入，终浓度为0.5mmol/l；按配制体积计算并分别称取适量的乙二胺四乙酸二钠、氯化镁、山梨酸钾加入，终浓度分别为1.5g/l，搅拌均匀，即为试剂1。
b)试剂2的配制：量取配制体积等体积的纯化水，选用三羟甲基氨基甲烷缓冲液，终浓度为250mmol/l，按配制体积计算并称取适量的三羟甲基氨基甲烷加入，调节ph为9.5，按配制体积计算并分别称取适量的蔗糖、抗坏血酸、牛血清白蛋白、山梨酸钾加入，终浓度分别为5g/l，按配制体积计算并称取适量的还原型辅酶ⅱ加入，终浓度为0.5g/l，搅拌均匀，即为试剂2。
c)校准品的配制：量取配制体积等体积的纯化水，选用三羟甲基氨基甲烷缓冲液，终浓度为50mmol/l，按配制体积计算并称取适量的三羟甲基氨基甲烷加入，调节ph为7.5，按配制体积计算并分别称取适量的酪蛋白、牛血清白蛋白加入，终浓度分别为5g/l，按配制体积计算并分别称取适量的海藻糖、抗坏血酸加入，终浓度分别为5g/l，按配制体积计算并称取适量的谷胱甘肽还原酶纯品加入，终浓度为80u/l，搅拌均匀，即为校准品。
上述谷胱甘肽还原酶测定试剂在谷胱甘肽还原酶测定中的应用，包括如下步骤：将待测样本、试剂1、试剂2按照6μl：150μl：50μl的体积比混匀后静置240秒，然后置于检测仪器中测量2.5分钟吸光度值(a)，计算每分钟吸光度变化率(△a/min)，其中：测试温度37℃、检测仪器主波长340nm、副波长405nm，光径1cm，使用纯化水和校准品进行线性校准，按公式：谷胱甘肽还原酶的浓度(u/l)＝c标准*(△a/min样本-△a/min空白)/(△a/min标准-△a/min空白)计算样本中谷胱甘肽还原酶的浓度，其中所述待测样本为血清，所述检测仪器为具有双试剂功能的全自动生化分析仪。
实施例二
一种谷胱甘肽还原酶测定试剂，所述试剂包括试剂1和试剂2，所述试剂1的组成成分包括：缓冲液、氧化型谷胱甘肽、稳定剂a，所述缓冲液为碳酸盐缓冲液，其终浓度为80mmol/l，所述稳定剂a为氯化镁，其终浓度为1g/l，氧化型谷胱甘肽终浓度为1mmol/l；试剂2的组成成分包括：缓冲液、还原型辅酶ⅱ、稳定剂b，所述缓冲液为甘氨酸缓冲液，其终浓度为500mmol/l，稳定剂b为蔗糖，其终浓度为1g/l，还原型辅酶ⅱ终浓度为1g/l；
该试剂还包括校准品，所述校准品的组成成分包括基质、纯品及稳定剂c，所述基质为缓冲液和牛血清白蛋白的混合物，其中缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液，其终浓度为80mmol/l，所述牛血清白蛋的终浓度分别为1g/l；所述纯品为谷胱甘肽还原酶，其终浓度为100u/l；所述稳定剂c为海藻糖，所述海藻糖的浓度为10g/l。
上述谷胱甘肽还原酶测定试剂的制备方法，包括如下步骤：
a)试剂1的配制：量取配制体积等体积的纯化水，选用碳酸盐缓冲液，其终浓度为80mmol/l，按配制体积计算并称取适量的碳酸盐加入，调节ph为7，按配制体积计算并称取适量的氧化型谷胱甘肽加入，终浓度为1mmol/l；按配制体积计算并分别称取适量的氯化镁，其终浓度分别为1g/l，搅拌均匀，即为试剂1。
b)试剂2的配制：量取配制体积等体积的纯化水，选用甘氨酸缓冲液缓冲液，终浓度为500mmol/l，按配制体积计算并称取适量的甘氨酸缓冲液加入，调节ph为9，按配制体积计算并称取适量的蔗糖加入，其浓度分别为1g/l，按配制体积计算并称取适量的还原型辅酶ⅱ加入，终浓度为1g/l，搅拌均匀，即为试剂2。
c)校准品的配制：量取配制体积等体积的纯化水，选用三羟甲基氨基甲烷缓冲液，终浓度为80mmol/l，按配制体积计算并称取适量的三羟甲基氨基甲烷加入，调节ph为7，按配制体积计算并称取适量的牛血清白蛋白加入，其终浓度为1g/l，按配制体积计算并称取适量的海藻糖，终浓度为10g/l，按配制体积计算并称取适量的谷胱甘肽还原酶纯品加入，终浓度为100u/l，搅拌均匀，即为校准品。
上述谷胱甘肽还原酶测定试剂在谷胱甘肽还原酶测定中的应用，包括如下步骤：将待测样本、试剂1、试剂2按照6μl：150μl：50μl的体积比混匀后静置180秒，然后置于检测仪器中测量2分钟吸光度值(a)，计算每分钟吸光度变化率(△a/min)，其中：测试温度37℃、检测仪器主波长340nm、副波长405nm，光径1cm，使用纯化水和校准品进行线性校准，按公式：谷胱甘肽还原酶的浓度(u/l)＝c标准*(△a/min样本-△a/min空白)/(△a/min标准-△a/min空白)计算样本中谷胱甘肽还原酶的浓度，其中所述待测样本为血浆，所述检测仪器为具有双试剂功能的全自动生化分析仪。
实施例三
一种谷胱甘肽还原酶测定试剂，所述试剂包括试剂1和试剂2，所述试剂1的组成成分包括：缓冲液、氧化型谷胱甘肽、稳定剂a，所述缓冲液为柠檬酸缓冲液，其终浓度为100mmol/l，所述稳定剂a为乙二胺四乙酸二钠和山梨酸钾的混合物，其中乙二胺四乙酸二钠和山梨酸钾的终浓度分别为2g/l，氧化型谷胱甘肽终浓度为0.1mmol/l；试剂2的组成成分包括：缓冲液、还原型辅酶ⅱ、稳定剂b，所述缓冲液为柠檬酸缓冲液，其终浓度为100mmol/l，稳定剂b为蔗糖和山梨酸钾的混合物，其中蔗糖和山梨酸钾的终浓度分别为10g/l，还原型辅酶ⅱ终浓度为0.1g/l；
该试剂还包括校准品，所述校准品的组成成分包括基质、纯品及稳定剂c，所述基质为酪蛋白和牛血清白蛋白的混合物，所述酪蛋白、牛血清白蛋的终浓度分别为1g/l和10g/l；所述纯品为谷胱甘肽还原酶，其终浓度为30u/l；所述稳定剂c为抗坏血酸、乙二胺四乙酸的混合物，所述抗坏血酸、乙二胺四乙酸终浓度分别为1g/l。
上述谷胱甘肽还原酶测定试剂的制备方法，包括如下步骤：
a)试剂1的配制：量取配制体积等体积的纯化水，选用柠檬酸缓冲液缓冲液，其终浓度为100mmol/l，按配制体积计算并称取适量的柠檬酸加入，调节ph为8，按配制体积计算并称取适量的氧化型谷胱甘肽加入，终浓度为0.1mmol/l；按配制体积计算并分别称取适量的乙二胺四乙酸二钠和山梨酸钾加入，终浓度分别为2g/l，搅拌均匀，即为试剂1。
b)试剂2的配制：量取配制体积等体积的纯化水，选用柠檬酸缓冲液缓冲液，终浓度为250mmol/l，按配制体积计算并称取适量的柠檬酸加入，调节ph为10，按配制体积计算并分别称取适量的蔗糖和山梨酸钾加入，终浓度分别为10g/l，按配制体积计算并称取适量的还原型辅酶ⅱ加入，终浓度为0.1g/l，搅拌均匀，即为试剂2。
c)校准品的配制：量取配制体积等体积的纯化水，称取适量的酪蛋白、牛血清白蛋白加入，所述酪蛋白、牛血清白蛋的终浓度分别为1g/l和10g/l，调节ph为8，按配制体积计算并分别称取适量的抗坏血酸和乙二胺四乙酸加入，终浓度分别为1g/l，按配制体积计算并称取适量的谷胱甘肽还原酶纯品加入，终浓度为30u/l，搅拌均匀，即为校准品。
上述谷胱甘肽还原酶测定试剂在谷胱甘肽还原酶测定中的应用，包括如下步骤：将待测样本、试剂1、试剂2按照6μl：150μl：50μl的体积比混匀后静置300秒，然后置于检测仪器中测量3分钟吸光度值(a)，计算每分钟吸光度变化率(△a/min)，其中：测试温度37℃、检测仪器主波长340nm、副波长405nm，光径1cm，使用纯化水和校准品进行线性校准，按公式：谷胱甘肽还原酶的浓度(u/l)＝c标准*(△a/min样本-△a/min空白)/(△a/min标准-△a/min空白)计算样本中谷胱甘肽还原酶的浓度，其中所述待测样本为血清，所述检测仪器为具有双试剂功能的全自动生化分析仪。
以上所述是本实用新型的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型所述原理的前提下，还可以作出若干改进或替换，这些改进或替换也应视为发明的保护范围。