多指标成分定量测定银杏叶中黄酮类成分含量的方法与流程

本发明涉及银杏叶中黄酮类成分含量的测定方法,具体涉及一种多指标成分定量测定银杏叶中黄酮类成分含量的方法。
背景技术：
：银杏又名公孙树、白果树等，其种子白果仁作为止咳平喘、缩小便、止带浊的中药在我国已有很久历史。其叶子银杏叶又称白果叶，是银杏科植物银杏的干燥叶，味苦、甘涩、性平、小毒。银杏叶药用最早载于《神农本草经》，早在宋朝我国民间就使用银杏叶治疗哮喘和支气管炎。我国药典中记载银杏叶有润肺、平喘、止痛之功效，用于肺虚咳嗽、冠心病心绞痛等。银杏叶的化学成分很复杂，迄今已发现170多种化合物，主要为黄酮类、萜类、醇类、生物碱类、聚异戊二烯类、多糖等具有药理作用的活性成分，有毒成分为银杏酸。随着银杏叶生物活性成分药理与毒理研究的深入，其药用功能逐步探明。银杏叶提取物是经现代提取工艺从银杏叶中提取的活性物质的富集产品，其主要活性成分为黄酮类和萜类。可用于疗肺虚咳喘、冠心病、高血脂、抑郁症、糖尿病、神经疾病、记忆障碍、外周血管疾病、间歇性跛行、脑转耳鸣等疾病的治疗。黄酮类成分包括单黄酮、黄酮醇苷、乙酰化黄酮醇苷、双黄酮、黄烷-3-醇类以及原花色素等。银杏黄酮具有扩张冠状血管、解痉、清除体内自由基等功能。中国专利申请201310372406.8公开了一种银杏叶药材实时放行检测方法，(1)采集银杏叶药材：采集不同产地的银杏叶药材样本，经粉碎后，过80目筛，得到粒度较均匀的银杏叶药材粉末；(2)测定银杏叶药材质控指标：选取水分含量、浸出物含量、黄酮醇苷含量作为银杏叶药材的关键质控指标；水分含量采用烘干称重法测定，浸出物含量采用热浸法测定，均参照2010版《中国药典》中对银杏叶的相关测定方法；黄酮醇苷含量采用高效液相色谱法测定，其中液相色谱条件：色谱柱：agilentsb-c18分析柱，4.6×250mm，5μm；流动相：甲醇-0.4％磷酸溶液50:50；检测波长360nm，流速为1ml/min，进样量为10μl；(3)采集银杏叶药材近红外光谱数据：称取银杏叶药材粉末，置于称量瓶中，保持粉末表面平整，采用漫反射法采集近红外光谱，以空气为参比，扫描次数为32，分辨率为8cm-1，扫描光谱范围为4000-10000cm-1；(4)建立银杏叶药材各质控指标的近红外定量模型和实时放行的定量标准：应用化学计量学软件将所得的近红外光谱信息与参比方法所测得的标准值进行关联，采用偏最小二乘法建立近红外光谱与质控指标之间的定量校准模型；(5)建立银杏叶药材质量的近红外定性模型和实时放行的定性标准。该方法可以在一定程度上保证银杏叶制剂批次间的稳定性和均一性。但该方法仅测试槲皮索、山柰素、异鼠李素3个含量,再折算成总黄酮醇苷的含量，对于黄酮醇苷类原型成分不能有效的控制其含量。目前对银杏叶、银杏叶提取物以及制剂中黄酮类化合物质量标准的研究,仅停留在采用酸水解,测定槲皮索、山柰素、异鼠李素3个含量,折算成总黄酮醇苷的含量的方法上,对于黄酮醇苷类原型成分的控制为空白。技术实现要素：本发明目的在于提供一种多指标成分定量测定银杏叶中黄酮类成分含量的方法，弥补现有药材质量控制技术不够完善和科学的不足，更好的控制银杏叶提取物的质量。本发明的技术方案为：一种多指标成分定量测定银杏叶中黄酮类成分含量的方法；该方法使用的对照品包括：取芦丁(rutin)、山柰酚-3-o-芸香糖苷(kgr)、异鼠李素-3-o-芸香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-ol-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(qrcg)和山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)。进一步地，所述多指标成分定量测定银杏叶中黄酮类成分含量的方法，包括以下步骤：(1)供试品溶液的制备称取银杏叶提取物加甲醇稀释；(2)对照品溶液的制备称取芦丁(rutin)、山柰酚-3-o-芸香糖苷(kgr)、异鼠李素-3-o-芸香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-对羟基反式桂皮酰)葡萄糖苷(qrcg)和山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含75μg、70μg、60μg、35μg、75μg、75μg的溶液，即得；(3)测定方法分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，分别计算芦丁(rutin)、山柰酚-3-o-芸香糖苷(kgr)、异鼠李素-3-o-芸香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-对羟基反式桂皮酰)葡萄糖苷(qrcg)和山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)的总量，计算6个黄酮醇苷的总量；其中，所述的液相色谱检测的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以流动相a：乙腈、流动相b：0.4％磷酸,按下表进行梯度洗脱；平衡时间10分钟；流速每分钟为0.8-1.2m1；检测波长为355-365nm；柱温45-48℃；理论板数按芦丁峰计算大于等于10oo0。进一步地，所述流速每分钟为0.8-1.2m1。进一步地，所述检测波长为355-365nm进一步地，所述柱温为48℃。进一步地，所述供试品溶液的制备：精确称取银杏叶提取物约50mg,至25ml容量瓶中，加入甲醇定容至25ml，经0.22μm滤膜过滤即得。色谱柱的选择本发明通过大量的实验筛选了不同的色谱柱，采用以下型号的色谱柱进行测定：①inertsilrods-3c18250mm×4.6mm5μm②ymc-packods-aq4.6×250mms-5μmno.0425059787③phenomenexgemini5μm110ac184.6×250mms/no.648173-11④inertsilods-3c18250mm×4.6mms-5μms/n1a7130799⑤thermosyncronisc18250×4.6mm5μm筛选实验结果表明，选用inertsilrods-3c18250mm×4.6mm5μm色谱峰分离良好，重现性最好。柱温的选择本发明分别在43℃、45℃和48℃柱温下进行分析，实验结果表时，在48℃柱温条件下，色谱峰分离情况最好，因此，将48℃作为最佳的柱温条件。本发明的方法稳定性高、重现性好，色谱条件容易实现；通过对黄酮醇苷类原型成分的测定，能准确、全面地控制银杏叶总黄酮的质量。为银杏叶提取物及其制剂的质量控制了新的分析方法并提供依据。附图说明图1混合对照品液相色谱图图2样品液相色谱图具体实施方式实施例1多指标成分定量测定银杏叶中黄酮类成分含量的方法1、仪器与药品1.1waters2689高效液相色谱仪1.2试剂与药品乙腈为色谱纯；磷酸为优级纯；共它试剂均为分析纯；水为超纯水。2、实验与结果2.1色谱条件为：色谱柱为：inertsilrods-3c18250mm×4.6mm5μm；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以流动相a：乙腈、流动相b：0.4％磷酸,按下表进行梯度洗脱；平衡时间10分钟；流速每分钟为1.0m1；检测波长为36onm；柱温48℃；理论板数按芦丁峰计算大于等于10oo0。2.2多指标成分定量测定银杏叶中黄酮类成分含量的方法，包括以下步骤：(1)供试品溶液的制备精确称取银杏叶提取物约50mg,至25ml容量瓶中，加入甲醇定容至25ml，经0.22μm滤膜过滤即得。(2)对照品溶液的制备称取芦丁(rutin)、山柰酚-3-o-芸香糖苷(kgr)、异鼠李素-3-o-芸香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-对羟基反式桂皮酰)葡萄糖苷(qrcg)和山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含75μg、70μg、60μg、35μg、75μg、75μg的溶液，即得；色谱图见图1。(3)测定方法分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，分别计算芦丁(rutin)、山柰酚-3-o-芸香糖苷(kgr)、异鼠李素-3-o-芸香糖苷(igr)、山柰酚-3-o-鼠李糖-2-葡萄糖苷(krg)、槲皮素-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-对羟基反式桂皮酰)葡萄糖苷(qrcg)和山柰酚-3-o-鼠李糖-2-o-(6-o-对羟基反式桂皮酰)-葡萄糖苷(krcg)的总量，计算6个黄酮醇苷的总量。2.3线性关系考察精密吸取对照品溶液(含rutin0.1996mg/ml，kgr0.2184mg/ml，igr0.1757mg/ml，krg0.1085mg/ml，qrcg0.2258mg/ml，krcg0.2181mg/ml)2μl、4μl、6μl、8μl、10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以进样量为横坐标，计算回归方程。结果见表1。表1成分回归方程线性范围(μg)相关系数(r)rutiny＝1809156x+70130.3933～1.99950.9999kgry＝1368942x-11070.4298～1.99160.9999igry＝1686403x-13100.3502～1.75490.9999krgy＝990565x-19350.2131～1.08620.9999qrcgy＝965477x-45310.4506～2.25910.9999krcgy＝891906x+9480.4337～2.18430.99992.4精密度试验精密吸取同一供试品溶液连续进样6次，rutin、kgr、igr、krg、qrcg和krcg的峰面积的rsd在0.58％-0.95％之间，均小于2％。结果表明：所建立的方法精密度良好。2.5稳定性试验精密吸取同一供试品溶液，分别于配制后0、2、4、8、16、24小时，依法测定，结果表明，供试品溶液在24小时内基本稳定，峰面积的rsd在0.33％-0.73％之间，均小于2％，可见样品在24h内稳定性良好。2.6重复性试验精密取6份供试品溶液，进行测定，各峰面积的rsd在0.54％-0.81％之间，均小于2％。结果表明，测定方法重现性良好。2.7准确度及范围试验采用加样回收法，1)精密称取0.5ml混合对照品溶液(含rutin0.07760mg/ml，kgr0.07153mg/ml，igr0.05992mg/ml，krg0.03547mg/ml，qrcg0.07824mg/ml，krcg0.07871mg/ml)，及同一已知含量的供试品溶液0.5ml，置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；2)精密称取已知含量的同一供试品溶液1.0ml及上述混合对照品1.0ml，混匀；3)精密称取上述混合对照品2.0ml，蒸干，精密加入已知含量的同一供试品溶液2.0ml，使溶解，平行制备3份，进行测定，结果显示，回收率rsd在0.36％-2.23％范围内，均小于3％；表明本方法具有很好的准确度。2.8银杏叶提取物含量检测按照2.2(1)对银杏叶提取物进行处理，进样测试。含量测定结果见表2。表2银杏叶提取物含量测定结果mg/ml样品rutinkgricrkrgqrcgkrcg6者之和10.08850.0910.08340.060.08310.05620.46220.08560.08870.08180.05940.0830.0570.45630.08950.09170.08350.06030.0820.05560.46340.06420.07480.08270.06620.10050.06690.45550.07980.06860.06920.05790.08920.05630.42160.6170.06210.06530.06930.10580.07160.436上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。当前第1页12