本发明涉及一种离子色谱检测黄连中多种有机酸含量的方法。
背景技术：
：黄连为毛茛科植物黄连coptischinensisfranch.、三角叶黄连coptisdeltoideac.y.chengethsiao或云连coptisteetawall.的干燥根茎，三种分别习称“味连”、“雅连”和“云连”。主产四川，湖北、湖南、陕西、甘肃等省亦有栽培。味苦、性寒，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经。具有清热燥湿，泻火解毒的功效。主要用于湿热痞满、呕吐吞酸、泻痢、黄疸、高热神昏、心火亢盛、心烦不寐、血热、目赤、牙痛、痈肿疔疮，外治湿疹、湿疮、耳道流脓。黄连含有黄酮类物质、氨基酸、有机酸等多种有效成分，有机酸是黄连的重要物质组成，研究表明，有机酸类成分具有抗肿瘤、抑菌、抗血酸、降血脂等广泛的生物活性，可以用来作为质量控制的指标。目前，已有文献报道了对黄连中有机酸的分离及检测，方法主要有薄层色谱法、毛细管电泳法和高效液相色谱法，但测定的有机酸种类仅涉及香草酸、阿魏酸等不超过4种有机酸，种类较少。考虑到黄连药材中的有机酸成分繁多，以少数有机酸的含量作为质量标准的指标可靠性不高。但目前尚无一次性对黄连中的奎尼酸、乙酸、酒石酸、草酸、柠檬酸等五种以上有机酸，进行同时测定的报道。技术实现要素：为了更有效的控制黄连药材质量，本发明的目的在于提供一种同时黄连中多种有机酸含量的方法。本发明提供了一种离子色谱检测多种有机酸含量的方法，步骤如下：a、制备供试品溶液：取黄连粉末，加水提取，过滤，得供试品溶液；b、制备对照品溶液：配制有机酸的混合标准工作溶液；c、分别将供试品溶液和对照品溶液注入离子色谱仪检测，色谱条件如下：色谱柱：as11-hc色谱柱；流动相：koh溶液；流速：0.9～1.1ml/min；梯度程序为：柱温：30℃；d、根据检测结果计算得到黄连中的有机酸含量。其中，所述有机酸为奎尼酸、乙酸、酒石酸、草酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、甲酸、乌头酸中的2种以上。进一步地，所述有机酸为奎尼酸、乙酸、酒石酸、草酸和柠檬酸；其中，所述有机酸还包括甲酸和乌头酸；和/或，所述有机酸还包括苹果酸和琥珀酸。其中，步骤a中，所述加水提取的条件为：在黄连粉末中加入50倍量的水，超声30min，然后放置30分钟。其中，步骤a中，所述过滤的条件为：将加水处理后的样品抽滤，过rp柱，然后过0.2um微孔滤膜即可。其中，步骤c中，所述离子色谱仪型号为ics-2100。其中，所述色谱条件的流速为1.0ml/min。其中，所述色谱条件的电导检测器检测池温度为35℃。其中，所述供试品溶液和对照品溶液的进样量为25μl。本发明通过对提取方法和色谱条件的筛选，成功建立了同时测定黄连中多种有机酸含量的离子色谱方法，该方法准确可靠、简便快速，为提高黄连的质量控制水平、促进药材的开发利用奠定了基础。同时，本发明的方法还可以准确检测不同基源黄连品种中5种以上有机酸成分，为黄连的临床应用提供了有效的参考。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1各种有机酸标准图谱具体实施方式下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。本发明所用的实验试剂，均可通过商业方式购买。其中，离子色谱仪：型号为ics-2100，厂家为美国热电。实施例1本发明方法测定黄连中有机酸含量1、标准溶液配制奎尼酸、乙酸、甲酸、酒石酸、草酸、柠檬酸、乌头酸混合标准储备溶液:分别称取各有机酸50mg于50ml容量瓶中，加水溶解定容，混匀，于4℃保存，其中各有机酸的质量浓度为1000μg/ml。奎尼酸、乙酸、甲酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、草酸、柠檬酸和乌头酸混合标准曲线工作液：分别吸取混合标准溶液(3.4.1)0.50ml、1.00ml、2.00ml、5.00ml、10.00ml于25ml容量瓶中，用超纯水定容至刻度，混匀，于4℃保存。2、样品处理先用磨碎机将少量试样磨碎，弃去，再磨碎其余部分，充分混匀，作为待测试样。称取2g±0.0020左右的黄连样品，置于250ml容量瓶中，精确加入100ml超纯水提取样品，摇匀，超声提取30min，放置30分钟后抽滤，过rp柱，过0.2um微孔滤膜，放置30min后待测。过rp柱的具体操作如下：rp柱首先用10ml甲醇活化，然后过15ml水，活化半小时后直接上样品提取液，弃掉前面3ml，收集后面流出液，即可。3.离子色谱1)色谱条件如下：色谱柱：as11-hc流动相：koh溶液(免化学试剂)外加水模式流速：1.0ml/min。检测器：电导检测器，检测池温度：35℃。柱温：30℃。进样量为25μl。2)标准曲线绘制：将标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪中,测定相应的峰高或峰面积。以标准工作液的浓度为横坐标,以色谱峰高或峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。3)样品溶液的测定将样品溶液注入离子色谱仪中,得到峰高或峰面积,根据标准曲线得到待测液中有机酸的浓度。4.结果分析试样中有机酸的含量按下式计算：式中：x----试样中被测组分含量，单位为克每千克(g/kg)；c----从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每毫升(μg/ml)；v----样品溶液最终定容体积，单位为毫升(ml)；m----样品溶液所代表最终试样的质量，单位为克(g)。以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。试验例1本发明方法的工艺参数筛选一、样品不同处理方式的比较实验比较了c18、rp柱对去除黄连提取液大分子有机物干扰的效果，方法如下：制备黄连供试品溶液时，通过将黄连提取液分别经过c18和rp柱，收集洗脱液，比较洗脱前后离子色谱干扰峰的面积，得出各小柱对黄连提取液有机物的去除率。结果见表1。表1c18、rp柱对去除黄连提取液大分子有机物干扰的结果可见，rp柱去除黄连提取液大分子有机物的效果最佳，可达93％，显著优于c18柱。二、不同色谱柱的分离效果比较实验比较了两种色谱柱(as11-hc和as-15)的分离效果，结果表明，as-15色谱柱在奎尼酸、乙酸和甲酸的分离效果不如as11-hc，分离度较差，达不到基线分离；而as11-hc相比as-15对本发明的有机酸均有良好的分离效果。试验例2本发明方法对不同基源黄连的测定结果分别取雅连(采自四川峨眉)、云连(采自云南福贡)、味连(采自重庆石柱)，按照实施例1的方法测定各自的有机酸成分。结果见表2。表2对不同黄连有机酸的检测结果雅连(mg/g)云连(mg/g)味连(mg/g)奎尼酸4.0027.832.90乙酸1.030.180.78苹果酸+琥珀酸9.9315.259.82酒石酸0.760.460.96草酸1.250.340.64柠檬酸1.401.531.19甲酸未检出未检出未检出乌头酸未检出未检出未检出可见，本发明方法可以测定不同基源的黄连中各种有机酸含量。试验例3本发明方法的方法学验证1、线性关系的考察配制包含以下线性范围的有机酸混合标准溶液，按照实施例1的方法进行离子色谱分析，并以各离子浓度和峰面积作图，得到各离子的工作曲线，结果见表3。表3不同有机酸的线性范围可见，各对照品在各自质量浓度范围内线性关系良好，说明本发明方法线性范围广，准确度高。2、检测限的考察配制10个接近空白的标准溶液，按照实施例1的方法，分别进行离子色谱分析，以3倍信噪比计算出各有机酸的定性检出限(以浓度表示)，10倍信噪比为各有机酸的定量检测限(浓度)。通过实施例1的称样量和定容体积，计算出检出限(以含量表示)。表4不同有机酸的检测限可见，本发明方法可以检测各种低浓度的有机酸，灵敏度高。3、回收率的考察以云连为例，分别在样品中添加三个浓度水平的各有机酸(1.添加50％的样品浓度；2.添加100％的样品浓度；3.添加150％的样品浓度)，按照实施例1的方法检测，得到的回收率范围见表5。表5有机酸的回收率(以云连为例)可见，使用本发明方法，样品回收率较高，说明本发明方法准确度高。。4、重复性的考察以云连为例，按照实施例1的方法，分别进行了6次重复测定，计算测定结果的rsd，结果见表6。表6有机酸的重复性(以云连为例)可见，使用本发明方法，各有机酸的相对标准偏差均小于10％，，说明本发明方法重复性良好。综上，本发明通过对提取方法和色谱条件的筛选，成功建立了同时测定黄连中多种有机酸含量的离子色谱方法，该方法准确可靠、简便快速，为提高黄连的质量控制水平、促进药材的开发利用奠定了基础。当前第1页12